地塞米松促进β-淀粉样蛋白引起大鼠学习记忆能力下降及机理研究

摘要

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，其特征性神经病理变化是老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失等，并以海马受累最严重。其病因尚不完全清楚，缺乏有效的治疗措施。因此，积极研究AD的发病机制是临床和基础医学面临的重要课题。 本研究拟(1)在体内，研究地塞米松(DEX)促进Aβ引起大鼠学习记忆能力下降和海马神经元损伤及其可能作用机制；(2)在体外培养大鼠海马神经元的基础上，进一步观察DEX促进Aβ引起海马神经元损伤，研究其可能的作用机制。为探讨AD发病机理提供理论依据。 　　目的：在体内外实验条件下，观察DEX、Aβ及其联合作用对海马神经元的影响，以探讨GCs是否加重Aβ的神经元毒性作用以及机理研究。 方法：利用大鼠海马CAl区注射Aβ25-35的方法建立大鼠早老性痴呆模型，运用Morris水迷宫和病理组织检查，研究DEX(1 mg/kg/d，5 mg/kg/d)和Aβ(5μg)以及联合作用对大鼠学习记忆能力和海马组织病理的影响。运用免疫组化的方法，检测DEX、Aβ以及DEX+Aβ对p-tau表达的影响。取孕18天Sprague Dawley(SD)大鼠胚胎的海马神经元进行体外原代分离培养，于联合实验中先加入10μM DEX作用24h后，再加入5μM Aβ25-35作用24h观察损伤情况。应用MTT法进行细胞活力分析；用western blot分析测定核NF-kB(Nuclear Factor kappa B)、p53和p-tau蛋白含量，用RT-PCR分析测定p53mRNA的水平，进一步探讨DEX是否通过下调核NF-kB出蛋白水平，上调p53和p-tau蛋白水平促进Aβ的神经元毒性。 结果： 1.大鼠海马CAl区注射Aβ25-35可诱导大鼠早老性痴呆模型，损伤大鼠的学习记忆能力。大鼠双侧海马CAl区注射5μgAβ25-35或sc，DEX(5 mg/kg/d，连续7d)，可使大鼠逃避潜伏期和游泳距离稍延长，但无统计学意义；1 mg/kg/d DEX，sc，连续7 d对大鼠逃避潜伏期和游泳距离无明显影响；DEX和Aβ25-35联合使用后d9，大鼠逃避潜伏期及游泳距离明显延长，并有部分动物死亡。病理检验结果显示，5 mg/kg/d DEX+5μg Aβ25-35组CAl区神经元数目明显减少，排列紊乱，脱失现象明显，核固缩为三角形或多角形，浓染。 2.免疫组化结果显示：溶剂对照组大鼠海马CAl区仅检测到少量tau阳性细胞。DEX(1 mg/kg)组p-tau阳性细胞数量稍增多(p>0.05)。DEX(5 mg/kg/d)、Aβ组大鼠海马神经元中p-tau阳性细胞数量明显增加，与溶剂对照组相比差异有显著性(p<0.05)。与Aβ组比较，DEX(1 mg/kg或5 mg/kg/d)+Ap组p-tau阳性细胞数量明显增多(p<0.05)。 3.细胞活力检测发现(MTT法)，不同浓度DEX(0.01，0.1，1，10 μM)对海马神经元活性没有影响(p>0.05)，Aβ25-35剂量依赖性地降低海马神经元细胞活力(p<0.05)。DEX(1 μM或10 μM)预处理海马神经元24 h，可进一步降低Aβ25-35(1 μM或5μM)引起的细胞活力下降(p<0.05) 4.在原代培养的海马神经元中加入5 μMAβ25-35后，分别于1 h，2 h，4 h，8 h提取胞浆蛋白和核蛋白，通过western blot分析结果显示：Aβ2-35能时间依赖性的引起核NF-kB p65蛋白水平增加，作用4 h后达到高峰，8 h后略有下降，但仍高于正常。与对照组相比，Aβ25-35组的核NF-kB表达量明显增加(p<0.05)，DEX 、DEX+Aβ25-35组变化不明显(p>0.05)。与Aβ组相比，DEX组可下调Aβ25-35引起的上升的海马神经元核NF-kB p65蛋白水平(P<0.05)；此外我们进一步研究了DEX与Aβ25-35联合作用对海马神经元胞质IKBa蛋白表达的影响。结果显示，与对照组相比，10μMDEX作用海马神经元时，胞浆Ik-Ba表达量增加(p<0.05)，Aβ25-35组表达量降低(P<0.05)，DEX+Aβ25-35组变化不明显(p>0.05)。与Aβ组相比，DEX可上调细胞质的IkBa蛋白水平(p<0.05)。 5.与对照组相比，10μM DEX作用海马神经元时，p53蛋白水平差异无统计学意义(p>0.05)；5 μM Aβ组差异有显著性(p<0.05)，但与同剂量的Aβ组相比，DEX+Aβ组的p53蛋白表达量变化不明显(p>0.05)。 6.与对照组(0 μM Aβ)相比，0.5，1，5μM的Aβ作用海马神经元1 h，p-tau表达量明显增加，10 μMAβ作用组，p-tau表达量达到峰值。此外，10μM DEX、5μMAβ作用海马神经元，其p-tau表达量也明显增加(p<0.05)，DEX+Aβ组的p-tau表达量与同剂量的DEX和Aβ相比，差异有显著性(p<0.05)。 7. RT-PCR结果显示：Aβ、DEX+Aβ促进p53 mRNA的水平增加(p<0.05)。DEX+Aβ组的p53 mRNA水平与同剂量的Aβ相比，差异无统计学意义(p>0.05)。 结论： 在体内，DEX可加重Aβ引起大鼠学习记忆能力下降，导致大鼠海马CAl区神经元数目明显减少、排列紊乱、脱失现象明显、核固缩为三角形或多角形、浓染，此外，免疫组化结果显示thr231位点磷酸化tau阳性细胞表达明显增加。以上结果提示：海马神经元损伤，学习记忆能力下降可能与神经细胞减少，tau蛋白异常磷酸化增多有关；在体外，DEX下调了Aβ25-35引起的上升的海马神经元核NF-kB蛋白水平，上调了细胞质中的IkBa蛋白水平，上调了Aβ25-35引起的上升的thr231位点磷酸化tau水平。从而提示DEX可能通过促进神经元胞内p-tau蛋白水平的升高、上调IkB蛋白水平或/和抑制核NF-kB蛋白水平来加重神经元毒性作用。此外，DEX+Aβ组的p53蛋白表达和p53 mRNA水平与同剂量的Aβ相比，差异无统计学意义，提示GCs促进Aβ引起海马神经元可能不通过p53途径。因脑内的Aβ随年龄不断增加，糖皮质激素增强Aβ的神经元毒作用可能是GCs诱导老年鼠记忆损伤的机制之一，也可能与AD病因学有关。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5.结论

参考文献

附录 个人简历

致谢

综述:糖皮质激素与海马神经元相关性研究