KLF4在结直肠癌中的表达及其在褪黑素抑制细胞增殖和迁移过程中的变化

摘要

背景：结直肠癌(colo rectal cancer,CRC)是胃肠道常见的恶性肿瘤之一,其发病率是所有肿瘤的第三位,严重威胁人类的健康和生命。在结直肠癌的发生发展过程中,涉及到一系列的基因变化。其中转录因子Krüppel-likefactor4(KLF4)引起了研究者广泛的关注的研究。转录因子通过激活或者抑制下游目的基因的转录来调控基因表达的时间特异性和组织特异性,在细胞的生长、分化和凋亡等过程中发挥重要作用。KLF4是在胃肠道富集的一种真核锌指蛋白转录因子,也被认为是调节细胞增殖和分化的重要反式作用因子。目前,已经认为KLF4表达的异常与肿瘤的发生有关,如乳腺癌中KLF4表达上调而食管癌中表达下调。掌握KLF4在结直肠癌中的表达规律,有利于提高我们对结直肠癌的认识,并为预防和治疗方法的改进提供依据。目前,褪黑素(melatonin,Mel)被认为对结直肠癌的治疗有积极意义。Mel主要是由松果腺分泌的一种吲哚类生物活性物质,近年来发现,除了胃肠道系统中广泛存在Mel受体外,Mel的分泌在胃肠道中也广泛存在,其分泌障碍可能会导致多种胃肠疾病。而且,与松果腺分泌Mel不同,胃肠道组织合成和分泌Mel不受光照周期调节,其主要调节因素可能是进食动作及食物成分。目前对于胃肠道中Mel的作用机制不是很清楚。探讨Mel对于结肠癌细胞的抑制作用,尤其是Mel对细胞增殖和迁移的抑制过程中,KLF4及其他相关蛋白的表达发生的变化,探讨其可能的信号通路及下游目的蛋白,对于阐明Mel的具体作用机制,及对疾病的预防和治疗都有积极的意义。
　　目的：尽管在一些体外研究中发现KLF4可能是结直肠癌的抑癌基因,但是KLF4在临床标本中的表达规律,目前还不清楚。本研究试图通过对临床病例进行分析,探讨临床相关指标如性别、年龄、是否转移和分化程度等,与KLF4表达之间的关系,并观察,用分化诱导剂丁酸刺激结肠癌细胞系RKO,观察其KLF4蛋白的表达是否发生变化。探讨Mel的作用过程中,RKO的KLF4是否会发生相应变化,并且观察Mel对细胞增殖的影响与细胞迁移能力的改变及其可能的分子机制。
　　方法：收集临床标本,应用组织微阵列结合免疫组织化学S-P法,检测109例临床标本中(40例正常结直肠黏膜,7例腺癌,62例结直肠癌)KLF4的表达,应用统计学的方法,分析KLF4的表达与临床病理参数之间的变化,并从临床标本中提取蛋白和RNA,分别采用Western-blot和RT-PCR的方法,分析KLF4蛋白表达水平mRNA的表达水平。用分化诱导剂丁酸刺激RKO细胞,用免疫细胞化学和RT-PCR的方法观察细胞中KLF4表达的变化。用不同浓度的Mel处理RKO细胞,MTT法测定细胞的增殖水平,Hoechst33258染色观察细胞的凋亡情况,并提取细胞总蛋白,采用Western-blot的方法,分析KLF4、凋亡相关蛋白等的表达水平的变化及其与细胞增殖变化之间的关系。用划痕实验分析Mel作用后细胞迁移能力的变化。并加入ERK抑制剂(PD98059)及PKC激活剂PMA分析引起这种变化可能的信号通路,加入MLCK抑制剂ML-7,分析MLCK在这个过程中所起的可能作用。
　　结果：在正常的结直肠黏膜中,KLF4高表达,与结直肠癌相比,KLF4的表达有显著性差异(p<0.05)。KLF4表达的强阳性率在正常黏膜、腺瘤和癌中分别是57.5％,28.6%和17.7%。KLF4的表达与性别、年龄、是否转移等临床指标之间没有显著性关联(p>0.05),但是与结直肠癌的分化程度有关,KLF4蛋白在高中分化和低分化的结直肠癌组织中表达的阳性率分别为95.8%和71.4%,其中强阳性率分别为22.9%和0%,有显著性差异(p<0.05),Western-blot和RT-PCR支持了上述结果。用分化诱导剂丁酸诱导结肠癌细胞系RKO,发现KLF4蛋白和mRNA水平表达都增加。用Mel作用于RKO细胞,生理剂量的Mel(ng级)对细胞的增殖没有明显抑制,毫摩尔浓度的Mel对细胞的增殖有抑制作用,并且Hoechst33258染色的结果也说明细胞发生了凋亡。通过Western-blot分析发现此过程中Mel膜受体与凋亡相关蛋白的表达发生了相应的变化,并且发现KLF4表达呈时间依赖性和剂量依赖性的上调。同时发现Mel作用下细胞p-ERK、MLCK、p-MLC等相关蛋白表达下降。分析上述相关蛋白对细胞迁移的影响,发现Mel和ERK的特异性抑制剂都可以抑制细胞的迁移。ERK信号通路的下调与细胞迁移能力下降有关。另外,MLCK表达的下调可能是Mel作用下,ERK通路的下游目的蛋白之一。
　　结论：正常结直肠黏膜中KLF4高表达;结直肠癌中KLF4表达下调,与正常黏膜有显著性差异;KLF4的表达与结直肠癌的分化程度有关,与性别、年龄和是否转移等无关;分化诱导剂丁酸可以诱导结肠癌细胞RKO中KLF4蛋白表达增加。毫摩尔级的Mel可以抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,Mel的作用使得膜受体MEL1AR表达上调,同时KLF4的表达也上调;Mel作用下的结直肠癌细胞RKO,其ERK信号通路下调,并且导致其迁移能力的下降。Mel作用下RKO细胞中MLCK表达下调,引起p-MLC表达下调,即肌球蛋白磷酸化的抑制,这是导致其迁移能力下调的可能原因。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

第一部分： 人结直肠肿瘤中KLF4的表达

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验内容与方法

3.结果

3.1 免疫组化结果：

3.2 KLF4在结肠癌组织中的表达与临床参数之间的关系

3.3 Western-blot 结果

3.5 KLF4表达在丁酸诱导的RKO细胞中的变化

3.6 小结：

第二部分褪黑素对RKO细胞增殖和迁移抑制作用的初步研究

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验内容与方法

3 结果

3.1 Mel对结肠癌细胞RKO细胞增殖的影响。

3.2 Mel对KLF4表达的影响

3.3 Mel对细胞迁移的影响

3.4 Western-blot结果

3.5 小结

5.结论

6. 本课题的创新点及对课题的进一步设想：

参考文献

附录：

致谢

综述：