神经生长因子对山羊骨髓间充质干细胞增殖及向成骨分化的调节作用

摘要

目的：体外培养山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）并向成骨方向进行诱导，通过加入神经生长因子（NGF），研究NGF在成骨培养基中对山羊BMSCs增殖及分化的影响。为阐明NGF促进牵张成骨术（DO）中骨形成的机理提供实验依据，希望所建立的实验方法能为将来进一步的临床和科研工作建立稳定的细胞模型，从而使牵张成骨术中促进牵张区新骨生成，解决临床问题提供一种可能。
　　 方法：抽取山羊骨髓，利用Percoll分离液进行密度梯度离心结合贴壁法分离山羊BMSCs，体外培养扩增，观察其形态学变化。体外培养至第三代后，首先用流式细胞仪检测细胞表面标志物，以鉴定细胞纯度，排除了杂质细胞的干扰；再将第三代BMSCs分为A、B、C、D四组，A组(空白对照组)：用含10％胎牛血清的低糖DMEM常规培养液培养。B组(成骨诱导对照组):成骨诱导液为常规培养液中加入10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。C组(NGF组)：常规培养液中加入终浓度为100ng/ml的NGF。D组(实验组)：成骨诱导液中加入终浓度为100ng/ml的NGF。于第3,5,7天利用MTT法测定各培养组细胞增殖活性，第14天检测各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素（OC）水平、第21天应用Von Kossa染色的方法检测钙结节的形成，比较各组细胞成骨性能，观察NGF对山羊BMSCs增殖及向成骨分化的影响。
　　 结果：⑴利用Percoll分离液进行密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化山羊BMSCs，是一种简便可行的方法，可获得较高的纯度，流式细胞术测得CD90、CD105为强阳性表达，CD34、CD45为阴性。⑵MTT法检测细胞增殖实验中，A组和C组细胞增殖率相似，B组和D组细胞增殖率相似，但B、D两组明显低于A、C两组，差异有显著性意义（p<0.05）。⑶各组细胞成骨性能检测结果：A组和C组ALP和OC表达均无明显差异（p>0.05），B组和D组ALP和OC表达明显高于A组和C组，且D组较B组表达水平增高，差异有显著性意义（p<0.05）。A、C两组细胞Von Kossa染色阴性，未见明显的钙化结节出现；B组细胞Von Kossa染色阳性，可见黑色钙化结节，D组较成骨诱导对照组钙化结节数目明显增多，面积增大。
　　 结论：密度梯度离心结合贴壁法是分离、纯化山羊BMSCs的简便实用的方法，传至第三代即可获得较高的纯度。单纯使用NGF对山羊BMSCs并无明显促进增殖及分化的作用，但NGF在山羊BMSCs向成骨细胞分化过程中具有明显的促进作用。这为加快骨形成，进一步进行相关的临床研究提供了实验基础。