Th1/Th2相关细胞因子在三氯乙烯致敏豚鼠肝损伤中的作用

摘要

研究背景：三氯乙烯(TCE)是一种有机溶剂，在工业上作为脱脂、清洗和去污剂应用广泛。职业暴露TCE的工人出现三氯乙烯药疹样皮炎(DMLT)伴肝功能损伤已经成为国内目前主要的职业卫生问题，近几年关于皮肤损伤的机制研究较多，多认为是迟发型超敏反应；但是DMLT患者往往伴有严重的肝损伤，继发的肝、肾多脏器损伤往往是DMLT死亡的直接原因，但是肝损伤的机制研究较少，现有的免疫和遗传多态性等机制不足以解释DMLT伴发的肝损伤。Th1/Th2细胞因子与炎症反应关系密切，而且各细胞因子之间形成一个相互影响、相互制约的网络体系，在启动炎症反应，调节炎症损伤方面起重要作用。
　　 目的：根据不同组别以及时点豚鼠肝脏中IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ表达水平，结合肝功能检查和病理学检查，探讨TCE肝损伤的作用机制。
　　 方法：选用体重250～300g/只，白色雌性豚鼠，经适应性饲养一星期后，随机分成空白对照组、溶剂对照组(橄榄油)、TCE组。采用豚鼠最大值试验(Guinea Pig Maximization Test，GPMT)方法建立豚鼠致敏模型，观察并记录豚鼠背部受试区的皮肤反应情况并进行拍照；依据《化学品毒性鉴定技术规范》(卫监督发〈2005〉272号)中规定的皮肤反应评分标准对豚鼠皮肤反应进行评分；当受试样品组动物皮肤反应积分≥1时，为皮肤致敏反应阳性，该动物被划分为致敏组，反之被划分为未致敏组。另外在末次激发前一天随机选取5只动物作为TCE14d组，采血并处死动物，无菌取肝组织。分别在末次激发后24h和72h分两批抽取豚鼠血液制备血清，用于测肝功能；并处死动物，无菌取肝脏，一部分做组织匀浆留取上清，考马斯亮蓝法测总蛋白，采用ELISA方法测定每克蛋白中细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的含量；另一部分肝脏用甲醛固定，免疫组化方法测定细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的表达；用SPSS13.0统计软件包对实验结果进行统计分析。
　　 结果：⑴致敏率。在皮肤致敏反应试验中，空白组、溶剂对照组和TCE14d组均未见红斑或水肿，在TCE试验组的30只动物中有19只出现红斑水肿，致敏率为63.3％。⑵病理学检查结果。空白对照组豚鼠肝细胞排列整齐，胞质均匀，胞核大而圆，核仁明显，核膜清晰；溶剂对照组未见明显异常；TCE未致敏组有一部分豚鼠肝脏能见到肝细胞水肿；TCE致敏组几乎所有动物都有肝细胞的水肿，但末次激发后24h水肿程度轻微，而末次激发后72h动物能见到较多大量肝细胞水肿，并有胞核破裂消失。⑶肝功能检查结果。溶剂对照组肝功能各指标与空白组相比，差异无统计学意义(p>0.05)；TCE致敏组ALT水平与溶剂对照组相比升高，差异有统计学意义(p<0.05)；而TCE未致敏组ALT水平与溶剂对照组相比有升高，但差异无统计学意义(p>0.05)；TCE致敏动物末次激发后72h动物的ALT和AST水平比激发后24h的明显升高，差异有统计学意义(p<0.05)；在72h的时点，致敏组比未致敏组ALT和AST水平也明显升高，差异有统计学意义(p<0.05)；TCE致敏72h组ALB水平比溶剂对照组、TCE14d组和TCE未致敏72h组升高(p<0.05)。⑷IL-12检测结果。溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05)；与溶剂对照组相比，在TCE激发后72h，致敏组和未致敏组豚鼠肝脏中水平均明显升高(p<0.05)。TCE未致敏组肝脏匀浆中IL-12水平比致敏组略高，但差异无统计学意义(p>0.05)。⑸IFN-γ检测结果。溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05)；与溶剂对照组相比，在TCE激发后24h和72h两个时点，致敏组和未致敏组豚鼠肝脏匀浆中水平均明显升高(p<0.05)。TCE致敏72h组较TCE14d组和TCE致敏24h组的肝脏IFN-γ水平显著升高，差异有统计学意义(p<0.05)；TCE致敏72h组较未致敏72h组豚鼠肝脏IFN-γ水平升高(p<0.05)。⑹IL-4检测结果。溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05)；与溶剂对照组相比，在激发后24和72h两个时点，TCE致敏组和未致敏组的豚鼠肝脏匀浆中IL-4水平均明显升高(p<0.05)；TCE14d组肝脏匀浆中IL-4水平与溶剂对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。TCE致敏组IL-4水平较TCE14d组和TCE未致敏组明显升高(p<0.05)。⑺IL-10检测结果。溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(p>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组与未致敏组均明显升高(p<0.05)；TCE14d组肝脏匀浆中IL-10水平与溶剂对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。⑻IFN-γ/IL-4。TCE各处理组IFN-γ/IL-4的比值与溶剂对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)；TCE致敏24h组比TCE未致敏24h组和TCE致敏72h组明显降低(p<0.05)。⑼IL-12/IL-10。溶剂对照组与空白组相比，差异无统计学意义(p>0.05)；TCE致敏组比溶剂对照组明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)；TCE14d组和TCE未致敏组与溶剂对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)；而TCE致敏24h组比TCE未致敏24h组明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)。
　　 结论：①采用豚鼠最大值试验可以建立TCE致敏模型，本实验条件下，TCE致敏率为63.3％。②TCE处理可造成豚鼠肝细胞的病理性和功能性损伤③IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ可能都参与了TCE的肝损伤过程。Th1/Th2平衡在TCE末次激发后24h向Th2倾斜，随着时间延长，到了72h，重新达到平衡。