慢性乙型肝炎病毒感染者家系隐匿性乙型肝炎病毒感染的调查研究

摘要

背景：在慢性HBV携带者的血清中通常存在HBsAg，它被认为是急性和慢性HBV感染的标志。然而，在一些患者，尽管在肝脏和外周血内存在病毒，但常规的血清学检测方法却检测不到这个抗原，亦即隐匿性HBV感染，是指血清HBsAg阴性，而血清或肝脏组织HBV DNA阳性。这种特殊形式感染可发生于抗-HBs和/或抗-HBc阳性的患者，也可见于乙肝五项检测全为阴性的个体。目前关于隐匿性HBV感染者不同人群中的发生率尚无确切的定论，关于其在慢性HBV感染者家系成员中的发生率报道亦不一致。通常这种特殊形式感染的病毒复制和基因表达水平非常低，但对引起这种情况的原因大部分是不清楚的。许多方法试图找出这种特殊形式感染的机制。有两种机制，一是这种抗原在外周血确实不存在，另一个是它存在于外周血中但没有被检测到。第一种机制可能是由于基因突变阻碍了抗原的输出，例如前S区特定位点的缺失。第二种机制是HBsAg虽然存在但标准的酶链免疫法却检测不到，可能是由于HBsAg与抗-HBs之间形成了循环免疫复合物减弱甚至完全抑制了抗原的检测。许多研究认为病毒低水平复制是外周血HBsAg阴性的主要原因，而有些研究却认为基因突变，尤其是HBV S区基因突变是引起隐匿性感染的主要原因，我国是乙型肝炎高发区，对隐匿性HBV感染应该引起高度重视。
　　 目的：研究慢性HBV感染者家系成员隐匿性HBV感染的发生率，并探讨其与研究对象年龄、性别、生化学检测结果以及乙型肝炎病毒标志物之间的关系，同时采用隐匿性HBV感染者的一级HBsAg阳性亲属作为对照，从S基因变异角度探讨隐匿性HBV感染可能的分子机制。
　　 方法：（1）病例选择和标本收集：病例选择的标准为：患者为确诊的慢性HBV感染者，所有的家系成员均未接种过乙肝疫苗。2007年12月至2009年12月在安徽医科大学第一附属医院及六安市人民医院感染科住院部和门诊部共收集了89例慢性HBV感染者，对其及其家系成员进行病史采集并收集血清标本，保存待检。（2）病毒DNA模板制备：采用经典的蛋白酶K消化-酚-氯仿方法。（3）引物设计：参考国内外文献及HBV参照序列，在HBV基因组S、C、X区分别设计一对巢式引物。（4）巢式PCR扩增，两个区同时阳性者定义为隐匿性HBV感染者，并计算慢性HBV感染者家系成员隐匿性HBV感染的发生率。（5）根据HBV参照序列，在S区设计引物，对HBV 两个区同时阳性者以及S区重复PCR阳性者进行测序，发现可能和HBV隐匿性感染有关的变异位点。同时对隐匿性HBV感染者的HBsAg阳性一级亲属进行测序，并比较其与隐匿性HBV感染之间的关系。
　　 结果：（1）在89例慢性HBV感染者家系成员共筛查到220例HBsAg阴性者，其中，151例抗-HBs阳性，44例抗-HBc阳性，33例抗-HBs和抗-HBc全阳者，56例抗-HBs和抗-HBc全阴者。220例样本全部进行了HBV S、C、X区的巢式PCR检测，其中3个区同时阳性者有5例，两个区同时阳性者20例，S区单独阳性者3例。因3例S区单独阳性者在后续的测序试验中测序成功，把其也作为隐匿性HBV感染者，因此，在本研究中隐匿性HBV感染的发生率约为12.7％。将28例隐匿性HBV感染者和192例HBsAg阴性、HBV DNA阴性者的一般情况及血清学和生化学检测结果相比较发现，两者的性别、年龄和生化学检测结果并不能区分隐匿性HBV感染者和非感染者，且发现在抗-HBc阳性者，隐匿性HBV感染的发生率更高(25.0％)，说明在既往有HBV感染史的患者，隐匿性HBV感染的发生率较高。（2）因其中一个标本为C区和X区同时阳性，没有进行小S区的测序，因此只有27个测序结果。在本研究的隐匿性HBV感染者和阳性对照共检测到了2种基因型（HBV/B,HBV/C），其中HBV/B占优势，但将隐匿性HBV感染者和阳性对照相比较，两者的基因型分布并无统计学意义（χ2=1.975，P=0.16）。通过测序发现，部分隐匿性HBV感染者（29.6％）在小S区不存在基因突变，而部分隐匿性HBV感染者则存在较多的基因突变（≥3个，25.9％），且有2例隐匿性HBV感染者提前形成终止密码子，形成缩短的氨基酸序列。与隐匿性HBV感染者相比，大部分（90％）阳性对照都存在基因突变，且隐匿性HBV感染者与阳性对照基因变异位点大部分不一致。而且，B基因型和C基因型隐匿性HBV感染者和阳性对照基因变异分布情况有明显差异，在B基因型，隐匿性HBV感染者变异较集中在小S基因的中间部位，而阳性对照基因变异较集中在小S基因的两边，且在B基因型隐匿性HBV感染者，W156L变异较常见（35.71％）。而在C基因型，其基因变异情况与B基因型不同，其基因变异分布于整个小S基因，而阳性对照基因变异分布则相对较集中，且在隐匿性HBV感染者，I68T（30.77％）和I126T（30.77％）变异较常见。
　　 结论：在慢性HBV感染者家系成员隐匿性HBV感染的发生率约为12.7％，且在抗-HBc阳性的研究对象隐匿性HBV感染的发生率较高（25.0％）。在一小部分隐匿性HBV感染者其小S区不存在基因突变，而大部分阳性对照都存在基因突变。将隐匿性HBV感染者和阳性对照相比较，发现两者的基因变异分布情况有明显差异，表明慢性HBV感染者家系成员的隐匿性HBV感染可能与基因变异有关。