人视黄醇结合蛋白4多克隆抗血清的制备及初步应用

摘要

目的:制备抗人视黄醇结合蛋白4(Retinal binding protein4，RBP4)的多克隆抗血清，初步应用于2型糖尿病（T2DM）患者的血清RBP4检测。
　　 方法:从成人正常肝脏组织中提取总RNA，RT-PCR法扩增人RBP4 cDNA全长，与pMD-18T Vector相连，构建克隆载体pMD-hRBP4。设计分别带BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的上下游引物，PCR后酶切，构建原核表达载体pET28a(+)-hRBP4，氯化钙法转化入BL21(DE3)，提取质粒双酶切鉴定并测序，将IPTG诱导表达的蛋白质产物用western blotting鉴定。对诱导表达的条件如IPTG的浓度、时间和温度等进行优化，镍亲和层析法纯化rhRBP4，免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗血清，Western blotting检测其特异性，ELISA法测定抗体效价。用多克隆抗血清检测T2DM患者血清RBP4水平。
　　 结果:重组质粒pET-28a(+)-hRBP4的双酶切结果与预期大小完全一致，测序结果证实所得的cDNA序列与GenBank中hRBP4的序列基本一致，Western blotting结果证实重组蛋白能够与hRBP4单克隆抗体特异性结合。IPTG诱导表达的最适浓度是0.04 mmol/L，最适时间为6 h，最适温度为37℃，表达的重组蛋白最多可达菌体总蛋白的44％，且以包涵体形式存在。SDS-PAGE电泳的结果表明亲和层析法得到的重组蛋白纯度为96％。ELISA法测定抗血清的效价为1：512000。Western blotting结果显示抗血清能够与T2DM患者血清中分子量21kDa的蛋白结合，与天然RBP4的大小一致。
　　 结论:成功构建和获得了hRBP4 cDNA全长的原核表达载体及rhRBP4蛋白，制备的多克隆抗血清可初步用于T2DM患者血清中RBP4的检测，为进一步的RBP4功能研究及临床大规模血清样本RBP4的检测奠定基础。