7,3'-二甲氧基橙皮素对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用及作用机制研究

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节肿胀、滑膜炎症和软骨破坏为特征的自身免疫性疾病，具有较高的发病率和致残率，是造成人群劳动力丧失的主要疾病之一。尽管RA的病因及发病机制尚未完全明确，但其主要的病理环节基本清楚，即免疫功能失调、关节滑膜细胞过度增殖与滑膜增厚、关节软骨与骨破坏等三个方面。目前尚缺乏真正有效而副作用小的治疗药物，因此，对RA的发生和发展过程予以系统而合理的解释，并寻找作用显著、副作用小的天然活性成分或其衍生物逐渐成为RA 药物的研究热点。
　　 本课题组的前期研究成果和国外相关文献均表明二氢黄酮类化合物——橙皮苷具有一定的抗风湿作用，然而其水溶性较差、生物利用度不高等缺陷限制了其在医药领域的广泛应用，目前国内外有关橙皮苷的结构改造方面有着深入地研究，通过橙皮苷结构修饰后得到的衍生物，其水溶性、吸收性以及其药物疗效都有了一定的改善。在前期工作中，我们针对橙皮苷的结构特征进行了结构修饰，得到了一系列橙皮苷衍生物。本课题正是在前期研究的基础上，对橙皮苷衍生物进行了抗炎活性筛选，并以佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠为对象，观察了具有较高抗炎活性的橙皮苷衍生物（7，3'-二甲氧基橙皮素）的抗风湿作用，同时从影响AA 大鼠免疫功能和滑膜细胞增殖/凋亡角度探讨了其治疗AA的可能作用机制，为将其开发为治疗RA的新药奠定实验基础。本课题的主要研究内容包括以下三个方面：
　　 1、橙皮苷衍生物抗炎活性的筛选研究
　　 目的：通过体内、外实验筛选橙皮苷衍生物抗炎活性。
　　 方法：放射免疫法、高效液相色谱法分别检测橙皮苷衍生物对AA 大鼠腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophage，PM Φ)前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)和白三烯B4 (leukotrieneB4，LTB4)生物合成的影响，采用二甲苯诱导小鼠耳肿胀模型对系列衍生物进行抗炎活性筛选，观察抗炎活性较好的衍生物对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀和AA 大鼠继发性炎症的影响。
　　 结果：衍生物2 （5，7，3'-三乙酰橙皮素）和衍生物5（7，3'-二甲氧基橙皮素，7，3'-dimethoxy hesperetin，DMHP）体外均显著抑制AA 大鼠PM Φ PGE2和LTB4的合成，并呈明显的剂量依赖关系；二甲苯诱导小鼠耳肿胀筛选实验结果也表明5，7，3'-三乙酰橙皮素和DMHP 具有良好的抗炎效果，作用与萘普生相当；进一步研究表明 7，3'-三乙酰橙皮素和DMHP 对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀和AA 大鼠的继发性炎症具有较好的治疗作用，且等摩尔剂量的DMHP 优于母体橙皮苷。
　　 结论：通过体内、体外实验筛选得到的橙皮苷衍生物——5，7，3'-三乙酰橙皮素和DMHP 抗炎活性较强，尤其是DMHP的抗炎作用显著优于橙皮苷，具有进一步研究开发前景。
　　 2、7，3'-二甲氧基橙皮素对AA 大鼠的抗炎免疫作用及部分机制研究
　　 目的：根据AA 大鼠的足肿胀度、多发性关节炎指数、体重和病理形态等改变，研究DMHP 对大鼠AA的治疗作用；以脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophage，PM Φ)、滑膜细胞等免疫细胞为靶点，探讨DMHP 调节AA 大鼠异常免疫功能的可能作用机制。
　　 方法：足趾皮内注射弗氏完全佐剂(Freund'scomplete adjuvant，FCA)诱导大鼠AA 模型；DMHP(22，44，88 mg/kg)灌胃给药；足容积法测量足肿胀度；称重法测定体重、胸腺和脾脏重量；HE 染色观察踝关节病理组织学变化并进行评分；免疫组化法观察血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)在滑膜组织中的表达；MTT 法和放射免疫法分别检测经ConA 诱导的脾脏T 淋巴细胞增殖反应和IL-2 水平；EILSA和RT-PCR法检测经LPS 诱导的PM Φ分泌的IL-1 β、IL-6、IL-10和TNF-α水平及基因表达变化；胶原酶-胰酶法分离培养原代滑膜细胞，放射免疫法和EILSA 法检测滑膜细胞分泌的PGE2和IL-1、TNF-α水平；并检测DMHP(2，10，50，250 μmol/L)体外给药对脾脏T 淋巴细胞增殖反应及PM Φ分泌IL-1 β、IL-6的影响。
　　 结果：DMHP体内给药可减轻AA 大鼠原发性和继发性足肿胀，显著降低AA 大鼠多发性关节炎指数、缓解AA 大鼠体重的下降和下调AA 大鼠升高的脏器指数；病理组织学检查和评分结果提示DMHP 在抑制AA 大鼠滑膜组织增生、减少炎细胞浸润、抑制血管翳形成，减轻骨及软骨破坏等方面均有明显疗效；DMHP 能下调AA 大鼠关节继发性炎症过程中VEGF 在滑膜组织中的表达；DMHP 可以明显恢复AA大鼠低下的脾脏T 淋巴细胞增殖反应和IL-2 产生，并能从转录水平和蛋白表达水平，抑制AA 大鼠PM Φ产生过高的IL-1 β、IL-6、TNF-α，而增加IL-10的产生；DMHP 还可以抑制AA 大鼠原代滑膜细胞亢进的分泌功能，降低PGE2和IL-1、TNF-α水平；体外实验结果也表明：DMHP 能恢复AA 大鼠低下的脾脏T 淋巴细胞增殖反应、降低AA 大鼠PM Φ IL-1 β、TNF-α的水平。
　　 结论：上述结果表明DMHP 对AA 大鼠继发性炎症具有明显的改善作用。DMHP 通过减少炎症介质的释放、促进抗炎细胞因子的产生，恢复细胞因子的网络平衡。调节AA 大鼠异常的免疫功能可能是DMHP 对AA 大鼠发挥治疗作用的重要途径之一。
　　 3、7，3'-二甲氧基橙皮素对AA 大鼠滑膜细胞凋亡的影响及可能机制研究
　　 目的：观察DMHP 体内、体外对AA 大鼠滑膜细胞凋亡的影响，并从Bcl-2基因家族、Caspase3、胞质游离钙浓度([Ca 2+]I)等角度探讨DMHP 诱导滑膜细胞凋亡的作用机制。
　　 方法：AA 大鼠造模后，DMHP(22，44，88 mg/kg)灌胃给药；TUNEL法原位检测滑膜细胞凋亡；免疫组化法检测滑膜组织Bcl-2、Bax的表达；MTT法检测滑膜细胞增殖反应。组织块培养法分离培养大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)；MTT 法检测DMHP 体外给药对AA-FLS 增殖反应的影响；Hoechst 33342 染色、DNA 琼脂糖电泳、透射电镜等方法观察DMHP体外给药对AA-FLS 凋亡情况；采用Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；RT-PCR、Western blot 法分别检测Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA及Bcl-2、Bax、Caspase3 p20 蛋白表达变化；紫外分光光度法检测Caspase3 活性；采用钙离子荧光探针(Fluo-3 AM)作为指示剂，活细胞工作站检测胞内钙离子浓度变化。
　　 结果：DMHP 体内给药能显著抑制AA 大鼠滑膜细胞增殖和诱导滑膜细胞凋亡，明显降低AA 大鼠滑膜组织中Bcl-2的表达、提高Bax表达，降低Bcl-2/Bax的比值；DMHP 体外给药作用于AA-FLS 48 h，DMHP 能剂量依赖性地抑制AA-FLS 增殖；DMHP 处理组AA-FLS 呈现出DNA 阶梯状条带和典型的凋亡细胞核形态；Annexin-V FITC/PI 双染法表明DMHP(50，250 μmol/L)可以显著提高AA-FLS 凋亡率；RT-PCR和Western blot 结果表明DMHP 体外给药能显著降低AA-FLS Bcl-2 mRNA和蛋白的表达、并使Bax和Caspase3 mRNA和蛋白水平有明显提高；紫外分光光度法结果也表明DMHP 体外能剂量依赖性地提高AA-FLS Caspase3 活性；胞外无Ca 2+时，[Ca 2+]I 在DMHP 给药前后略有增加但无统计学差异，而胞外有Ca 2+时，[Ca 2+]I 缓慢增加，统计学结果表明[Ca 2+]I 在DMHP 给药前后有显著差异。
　　 结论：DMHP 体内、体外均能显著抑制滑膜细胞增殖、诱导滑膜细胞凋亡，这可能是DMHP 控制AA 大鼠增生性滑膜炎的关键。
　　 调节Bcl-2/Bax的表达、促进Caspase3表达和活化以及促进胞外钙离子内流、引起[Ca 2+]I 升高是DMHP 促进滑膜细胞凋亡的可能机制。