5,7,3'-三乙酰橙皮素对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用及其部分机制的研究

摘要

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的软骨及骨破坏为主要表现的慢性自身免疫性疾病,具有较高的发病率和致残率,严重影响人们的正常生活,也是造成人群劳动力丧失的主要疾病之一。但至今该病的发病机制尚未完全明确,大量研究证实其病理环节为免疫功能失调、关节滑膜细胞过度增殖与滑膜增厚、关节软骨与骨破坏等三个方面。治疗关节炎的药物有很多,但尚缺乏真正有效而副作用小的治疗药物。为了系统而合理的解释RA的发生和发展过程,因此,寻找作用显著、副作用小的RA治疗药物成为RA的研究热点。
　　橙皮苷(hesperidin,HDN)为橙皮素与双糖芸香糖形成的二氢黄酮苷类化合物,本实验室前期的研究证明,HDN具有较强的抗炎镇痛作用和免疫调节功能,对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠具有治疗作用。然而其水溶性较差、生物利用度不高等缺陷限制了其在医药领域的广泛应用,目前国内外对橙皮苷的结构改造方面有着深入的研究,通过橙皮苷结构修饰后得到的衍生物,其水溶性、吸收性以及药物疗效都有了一定的改善。在前期研究中,我们针对橙皮苷的结构特征进行了结构修饰,得到了一系列橙皮苷衍生物,对橙皮苷衍生物进行了抗炎活性筛选发现,5,7,3'-三乙酰橙皮素(5,7,3'-teiacetyl hesperetin,TAHP)和7,3′-二甲氧基橙皮素(7,3'-dimethoxy hesperetin, DMHP)具有较好的抗炎活性。本课题以AA大鼠为对象,观察TAHP对AA大鼠的治疗作用,同时从影响AA大鼠滑膜组织或细胞增殖/凋亡角度探讨了其治疗AA的可能作用机制,为将其开发为治疗RA的新药奠定实验基础。
　　主要内容概括如下:
　　第一部分：1.5,7,3'-三乙酰橙皮素对AA大鼠的治疗作用及对Jak2/Stat3信号通路的抑制作用
　　目的:明确TAHP对AA大鼠的治疗作用,并进一步阐述TAHP在调节Jak2/Stat3信号通路过程中的重要作用。方法:用弗氏完全佐剂造佐剂性关节炎模型。分三个剂量组灌胃给药:33 mg/kg,66 mg/kg,132 mg/kg。检测继发性足肿胀、多发性关节炎指数、免疫器官指数、体重的变化以及病理,评价TAHP对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用。ELISA法检测血清中IL-6的分泌水平, RT-PCR和Western blot法检测Jak2/Stat3信号通路相关分子的表达。结果:TAHP(66,132 mg/kg)可以抑制继发性足肿胀,恢复免疫器官指数以及降低多发性关节炎指数。病理结果表明TAHP可以不同程度的缓解AA的病理特点,下调血清IL-6的分泌水平,并降低滑膜组织中Stat3和Jak2的mRNA表达和p-Jak2/Jak2和p-Stat3/Stat3的表达。结论:TAHP对AA具有治疗作用,其机制可能与抑制Jak2/Stat3信号通路有关。
　　第二部分：2.5,7,3'-三乙酰橙皮素对AA大鼠成纤维样滑膜细胞Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响
　　目的:研究TAHP对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响。方法:用弗氏完全佐剂诱导大鼠AA模型;MTT法检测FLS的增殖反应;Hoechst33258染色法检测FLS的凋亡;RT-PCR法检测FLS中Jak2、Stat3、Bcl-2、Bax及Caspase-3的基因表达;Western blot法检测FLS中p-Stat3及Caspase-3的蛋白表达情况。结果:TAHP呈剂量和时间依赖性抑制FLS的增殖(P<0.05);Hoechst33258染色结果暗示了TAHP可以明显地促进FLS的凋亡;同时TAHP(50,250μmol/L)可以明显降低Jak2、Stat3及Bcl-2表达,而上调Bax及Caspase-3表达;Western blot结果显示,TAHP可降低p-Stat3的表达、上调Caspase-3表达。结论:TAHP可以抑制FLS增殖,其作用机制可能与抑制FLS Jak2/Stat3信号通路、促进Bax及Caspase-3表达、抑制Bcl-2的表达有关。

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实验一5, 7, 3'-三乙酰橙皮素对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用及对Jak2/Stat3信号通路的抑制作用

1前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 药品与试剂

2.3主要仪器

3 实验方法

3.1佐剂性关节炎大鼠模型的建立[9]

3.2 实验分组与给药方案

3.3 体重的测定

3.4 足肿胀测定

3.5 多发性关节炎指数(polyarthritis index, PI)评分[10]

3.6 脾及胸腺指数

3.7 关节组织病理学检查和组织病理学评分

3.9 MTT法检测滑膜细胞的增殖水平

3.10 血清IL-6水平测定

3.11 ELISA 法

3.12 RT-PCR 法检测滑膜组织 Stat3、Jak2的 mRNA 的表达

3.13 Western blot 法检测Stat3、p-Stat3、Jak2、p-Jak2的蛋白表达

3.14 统计学处理

4.结果

4.1 TAHP对AA大鼠继发性炎症的治疗作用

4.2 TAHP对AA大鼠膝关节组织病理学的影响

4.3 TAHP对滑膜细胞增殖反应的影响

4.4 TAHP对血清IL-6分泌水平的影响

4.5 TAHP对滑膜组织中 Stat3、Jak2 mRNA的表达的影响

4.6 TAHP 对滑膜组织中Stat3、p-Stat3、Jak2、p-Jak2 蛋白表达的影响

5 讨论

实验二5, 7, 3'-三乙酰橙皮素对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞的增殖与凋亡的作用

1前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 药品与试剂

3.实验方法

3.1 大鼠滑膜细胞的分离、培养

3.1 MTT法检测滑膜细胞的增殖水平

3.2 Hoechst 33258法检测AA-FLS的凋亡

3.4 Western bloting法检测p-Stat3及Caspase-3的蛋白表达

3.5 统计学处理

4 结果

4.1 不同浓度的TAHP对成纤维样滑膜细胞增殖的影响

4.2 TAHP对AA-FLS凋亡的影响

4.3 TAHP对AA-FLS Jak2、Stat3、Bcl-2、Bax及Caspase-3的mRNA表达的影响

4.4 TAHP对AA-FLS p-Stat3及Caspase-3的蛋白表达的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述