循环DNA甲基化作为胃癌分子标志物的研究

摘要

目的：(1)通过甲基化芯片筛选出在胃癌细胞中发生异常甲基化的基因。(2)进一步研究候选基因甲基化作为胃癌诊断标志物的可行性。(3)在胃癌细胞系中GATA6启动子发生高甲基化，研究其在胃癌细胞增殖及转移过程中的生物学意义。　　 方法：(l)通过Roche-NimbleGen DNA高密度的甲基化芯片，对6例正常胃粘膜组织和9株胃癌细胞系DNA进行全基因组CpG位点分析，筛选出在胃癌细胞株中发生高频甲基化基因作为候选的肿瘤标志物。(2)通过甲基化特异性PCR(MSP)分析候选基因在胃癌患者组织中及血清中甲基化发生率，并分析血清中这些基因甲基化检测作为胃癌诊断的可行性。(3)结合去甲基化试剂5-Aza-CdR处理，探讨去甲基化对胃癌细胞系中这些高甲基化基因再表达的影响。(4)用real-time PCR方法检测GATA6基因在18例胃癌组织及其癌旁组织中的表达情况。(5)用免疫组织化学染色法检测GATA6在胃癌组织芯片中的表达，并分析它们在肿瘤中的表达与胃癌临床病理特征的关系。(6)结合去甲基化试剂5-Aza-CdR处理，探讨去甲基化对胃癌细胞系中GATA6基因再表达的影响。(7)将GATA6表达载体pcDNA3.1+/hG6和空载体pcDNh3.1+转染至胃癌细胞株SGC7901，G418筛选稳定表达细胞株(SGC-7901/vector和SGC-7901/GATA6)，用Westernblot检测GATA6的表达以鉴定稳定转染株。(8)观察GATA6过表达后对SGC-7901细胞细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。　　 结果：(1)通过Roche-NimbleGen DNA高密度的甲基化芯片发现了82个基因，其启动子区域在胃癌细胞系中发生高甲基化而在正常胃粘膜中发生低甲基化或未甲基化。（2)从中选出15个基因，采用MSP在组织和血清中中验证，结果显示，在胃癌患者胃癌组织、癌旁组织及血清中甲基化率发生高的基因有BX141696、WT1、CYP2681和KCNA4，与健康对照的胃粘膜组织及血清对比，差异均具有显著性(p<0.05)；对胃癌患者血清中及组织中这些基因的甲基化状态进行Pearson相关系数分析，显示WTl(r=+0.505，p=O.027)和KCNA4(r=+0.664，p=0.002)具有较好的相关性；血清中联合检测CYP2681和KCNA4基因的甲基化状态，可以显著提高敏感度（达91.3％），且仍具有较高敏感度(92.1%)；分析胃癌病人的临床病理特征与这些基因甲基化状态关系发现，WTI在胃癌患者血清中的甲基化状态与肿瘤浸润深度(p<0.05)及临床分期(p<0.05)相关；CYP26BI在胃癌患者血清中的甲基化状态与淋巴结转移情况(p<0.05)及临床分期(p<0.05)相关。(3)去甲基化试剂5-Aza-CdR处理可以使胃癌细胞的BX141696、WT1、CYP2681和KCNA4基因表达量升高。(4) GATA6甲基化发生率在胃癌组织中为59.4%(19/32)，在癌旁组织中为50.0%(16/32)，而在正常胃粘膜中为28.6%(6/21)。胃癌组织与正常胃粘膜相比，差异具有显著性(p<0.05)。(5)定量PCR结果显示，与癌旁组织相比，GATA6在胃癌组织中表达下降，且差异有显著性(p<0.05)；免疫组织化学染色结果显示，GATA6在胃癌组织中的相对表达量为0.93±0.72，癌旁组织中相对表达量为1.45±0.76，差异具有统计学意义(p