循环甲基化DNA作为胃癌诊断和预警标志物及胃癌细胞周期基因表达谱的研究

摘要

目的：从DNA甲基化角度寻找胃癌诊断和预警的标志物，研究标志物之一的MYLK在胃癌进展中的生物学功能及其作用机制。此外，为探讨胃癌发生的机制，研究胃癌细胞周期各时相转换过程中基因表达谱的变化。
　　 方法：通过NimbleGen启动子区域CpG岛芯片，对9株胃癌细胞株和6例正常胃粘膜组织的DNA进行启动子区域甲基化检测，筛选出胃癌高甲基化基因作为候选的胃癌诊断和预警标志物。然后用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别在58例胃癌患者(术前/术后)、46例胃癌癌前疾病患者(不典型性增生、肠化生和慢性萎缩性胃炎)和30例健康人的血清标本中验证，并对候选标志物分子做临床病理学参数相关性分析。
　　 以免疫组化染色检测62对胃癌患者的肿瘤组织及其对应癌旁组织中MYLK的表达。分别从胃癌患者肿瘤和癌旁组织中分离、培养原代肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)和癌旁成纤维细胞(CPFs)，并检测MYLK在其中的表达。以siRNA方法下调CAFs中MYLK的表达，并将下调前后的CAFs分别与胃癌细胞SGC7901共培养，观察单独培养的SGC7901细胞(SGC7901组)，和CAFs共培养的SGC7901细胞(SGC7901+CAFs组)，及其和MYLK下调后的CAFs共培养的SGC7901细胞(SGC7901+CAFs-MYLK(-)组)增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的变化。以细胞因子芯片检测CAFs和SGC7901细胞共培养上清、单独CAFs、SGC7901细胞培养上清中细胞因子的差异。观察CAFs和SGC7901细胞共培养后以及外源性HGF、IGFBP-1和MYLK特异性抑制剂作用于CAFs后，MYLK表达、CAFs生物学特性及SGC7901细胞后上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的改变。
　　 以胸腺嘧啶核苷(thymidine)-偌考达唑(Nocodazole)及双胸腺嘧啶核苷(doublethymidine)法进行细胞同步化，分别阻断并于释放后0-12h收集细胞，流式细胞仪检测细胞同步化的程度。选择细胞周期中9个不同关键时间点的细胞样本并抽提mRNA，用cDNA microarray分析基因表达谱差异。
　　 结果：甲基化芯片筛选出82个差异基因，其启动子区域在胃癌中高甲基化，正常胃粘膜中低甲基化或未发生甲基化。MSP检测候选基因BCAS4、CHRM2、FAM5C、PRAC和MYLK在胃癌患者、胃癌癌前疾病患者和健康人血清中的甲基化阳性率：BCAS4分别为32.8％(19/58)、54.4％(25/46)和100％(30/30)；CHRM2分别为31.0％(18/58)、15.2％(7/46)和6.7％(2/30)；FAM5C分别为31.0％(18/58)、6.5％(3/46)和3.3％(1/30)；PRAC分别为65.5％(38/58)、28.3％(13/46)和36.7％(11/30)；MYLK分别为70.7％(41/58)、28.3％(13/46)和6.7％(2/30)。CHRM2，FAM5C和MYLK的甲基化阳性率随病情进展呈正相关性。其中胃癌患者血清中FAM5C和MYLK在胃癌患者术后血清中的甲基化阳性率较术前有明显下降(P<0.001)。评价甲基化联合检测用于胃癌诊断意义的ROC曲线，FAM5C和MYLK联合检测的曲线下面积(AUC=0.838)高于单个基因(0.639和0.820)。FAM5C和MYLK甲基化联合检测在胃癌患者和癌前疾病患者中的敏感性分别达到77.6％(45/58)和30.4％(14/46)，特异性达到90％。FAM5C和MYLK联合甲基化检测阳性率术后为24.1％(14/58)，明显低于术前的77.6％(45/58)(P<0.001)。FAM5C和MYLK联合甲基化检测与肿瘤大小(P<0.001)、肿瘤浸润深度(P=0.001)和TNM分期(P=0.003)有相关性。
　　 组织免疫组化染色显示62例胃癌肿瘤和癌旁组织标本中有45例(72.6％)MYLK表达于肿瘤组织的间质细胞，而在肿瘤细胞中不表达或低表达；在45例间质表达的标本中有27例(60％)MYLK的表达肿瘤组织中高于癌旁组织。原代成纤维细胞CAFs中的FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表达量高于CPFs(P<0.05)。与CAFs共培养后SGC7901细胞的增殖能力明显升高(P=0.018)；而与SGC7901+CAFs组相比，将CAFs中的MYLK下调后则不能增加SGC7901细胞的增殖能力，差别有统计学意义(P=0.046)。与CAFs共培养后SGC7901细胞的凋亡率虽有所下降，但无统计学意义的差异(P=0.169)；而与SGC7901+CAFs组相比，将CAFs中的MYLK下调后则明显促进SGC7901细胞的凋亡(P=0.032)。与SGC7901组相比，SGC7901+CAFs组SGC7901细胞的迁移(37.2±15.992 vs77.7±13.483，P<0.05)和侵袭(28.1±3.315 vs59.1±7.141，P<0.05)增加；与SGC7901+CAFs组相比，SGC7901+CAFs-MYLK(-)组SGC7901细胞的迁移(77.7±13.483 vs61.0±13.132，P<0.05)和侵袭(59.1±7.141 vs50.8±5.160，P<0.05)减少。CAFs和SGC7901细胞共培养后，HGF和IGFBP-1细胞因子表达均明显升高。CAFs与SGC7901细胞共培养后或将外源性的HGF或IGFBP-1作用于CAFs后，CAFs中FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表达明显升高(P<0.05)；而抑制CAFs中MYLK的活性后，FAP、α-SMA和MYLK mRNA表达明显降低(P<0.05)。同时SGC7901细胞与CAFs共培养后或将外源性的HGF和IGFBP-1作用于SGC7901细胞后，其EMT标志物E-cadherin mRNA表达降低，而N-cadherin、Twist1、Twist2、Snail、Slug mRNA表达升高，具有明显的EMT特征性变化(P<0.05)。
　　 表达谱芯片筛选出得到2001个在9个时间点均可信的基因，其中959个基因在细胞周期中发生明显的上调或下调。其中细胞生长相关基因有2个，细胞凋亡相关基因有12个，细胞周期相关基因有16个，染色质蛋白相关基因有7个，DNA复制相关基因有4个，转录相关基因有56个，DNA修复相关基因有2个，蛋白质合成相关基因有91个，癌基因15个，黏附分子相关基因8个，信号转导相关基因101个，细胞结构基因33个，代谢相关基因160个，其他未分类的基因有448个。
　　 结论：血清FAM5C和MYLK联合甲基化检测在胃癌和癌前疾病中的敏感性和特异性均高于目前临床上的一般检测手段；可用于评估手术效果和监测复发；并能对临床病理分期和肿瘤浸润深度起到一定的提示作用，有望成为胃癌诊断和预警的标志物。
　　 CAFs可促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。MYLK是调控胃癌CAFs生物学特性的一个重要分子，并有可能成为潜在的CAFs活化标志物。
　　 胃癌细胞周期各时相转换过程中发生广泛的基因表达谱改变，为胃癌发生机理的阐明提供了研究基础。