沙门氏菌特异性靶点的筛选及荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

本研究利用生物信息学手段,通过比对沙门氏菌及其他原核生物的基因组序列,发掘出361段沙门氏菌特异性片段作为候选分子检测靶点。从这些序列中随机挑选出30个序列片段,设计普通PCR引物,并用58株沙门氏菌菌株和22株非沙门氏菌菌株对每对引物的检测特异性进行评价,筛选出15对特异性较好的引物。经进一步灵敏度评价,得到6对检测灵敏度较好的引物,分别为:c1(36.5fg/PCR,500 cfu/mL);c3(36.5fg/PCR,500 cfu/mL);c20(36.5fg/PCR,500cfu/mL);c23(36.5fg/PCR,5×104cfu/mL);c24(36.5fg/PCR,500cfu/mL)和plc(36.5fg/PCR,500cfu/mL)。用鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)人为污染牛奶样品后,用建立好的普通PCR方法进行检测验证,当初始接种菌量为8 cfu/25g牛奶时,引物c3,c20,c24和plc均能在增菌6-8小时内检出阳性结果;而严重污染的牛奶样品(＞104cfu/25g牛奶)则只需增菌2-4小时即可检出沙门氏菌。在普通PCR方法的基础上,挑选出一段特异性较好的沙门氏菌基因组片段,设计出MGB-TaqMan探针p4以及相应的引物。同时,利用DNA随机重组技术构建扩增内标探针,合成单链寡核苷酸直接作为内标模板,以指示由PCR抑制剂等因素引起的假阴性结果,建立沙门氏菌实时荧光PCR检测方法,并对其特异性、灵敏度、抗干扰性以及在食品样品中的实际检测能力进行评价。经40株沙门氏菌和24株非沙门氏菌检测验证,荧光定量PCR具有良好的特异性,以肠炎沙门氏菌(CDC H3526)基因组DNA作为模板,检测灵敏度达到18.6fg/PCR;以鼠伤寒沙门氏菌(CDC G7601)基因组DNA作模版,PCR反应检测灵敏度为40.2fg/PCR。在鸡肉样品中自然存在背景菌群的干扰下,PCR检测限为130cfu/mL,且PCR定量结果与实际接入的沙门氏菌量处于相同或相近水平。用所建立的荧光定量PCR方法检测人工污染至鸡肉样品中的沙门氏菌,当污染量低至5cfu/10g样品时,经6小时非选择性增菌后,检验结果与标准方法符合率为23/24(95.8％);人工污染液体鸡蛋样品,初始接种量低至1cfu/10g样品时,检出率为100%,并与标准检测方法结果吻合;荧光定量PCR方法对人工污染沙门氏菌的花生酱样品检出率为26/27(96.3%),与标准方法符合率为35/36(97.2%),检测限低至3cfu/10g样品。

目录

摘要

Abstract

1 绪论

1.1 背景

1.2 沙门氏菌及其危害性

1.3 沙门氏菌的分离和鉴定方法

1.3.1 传统分离鉴定方法

1.3.2 快速检测方法

1.4 荧光定量PCR 原理及应用

1.5 沙门氏菌分子检测靶点

1.5.1 现有靶点

1.5.2 用生物信息学方法发掘新靶点

1.6 扩增内标在PCR 检测中的应用

2 沙门氏菌特异性靶点的筛选和普通PCR 检测方法评价

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂与培养基

2.1.3 DNA 提取及纯度分析

2.1.4 检测靶点的发掘及引物设计

2.1.5 PCR 反应及电泳检测

2.1.6 特异性评价

2.1.7 灵敏度评价

2.1.8 人工污染牛乳样品的检测

2.2 结果与分析

2.2.1 特异性

2.2.2 灵敏度

2.2.3 人工污染样品的检测

2.3 讨论

3 沙门氏菌荧光定量PCR 检测方法的建立与优化

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 培养基与试剂

3.1.3 DNA 提取及纯度分析

3.1.4 引物与目标探针

3.1.5 扩增内标的构建

3.1.6 PCR 体系优化

3.1.7 特异性验证

3.1.8 灵敏度评价

3.1.9 自然背景菌群干扰下的检测限

3.1.10 食品样品人工污染实验

3.2 结果与分析

3.2.1 引物的初步筛选

3.2.2 Real-time PCR 体系的优化

3.2.3 特异性验证

3.2.4 检测灵敏度评价

3.2.5 自然背景菌群干扰下的检测限

3.2.6 食品样品人工污染实验

3.3 讨论

4 总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文