抗人MMP-2单克隆抗体的制备及应用组织芯片技术研究卵巢癌中MMP-2和P185蛋白的表达和临床意义

摘要

目的:制备抗基质金属蛋白酶-2(MMP-2)单克隆抗体和多克隆抗体,对其生物学特性进行鉴定。并检测卵巢癌组织中MMP-2和P185蛋白的表达水平,探讨二者在卵巢癌发生发展中的作用、相互关系及其与卵巢癌临床病理特征之间的关系。为卵巢癌的发病、侵袭转移机制的研究及临床非手术靶向治疗提供理论依据。
　　方法:MMP-2是小分子化合物,需要与大分子载体偶联后才具有免疫原性。本研究采用戊二醛法,将MMP-2分别与载体蛋白牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)合成免疫抗原,与载体钥孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)合成包被抗原,再经间接ELISA与SDS-PAGE电泳实验证明半抗原与载体蛋白是否偶联成功。以人工抗原MMP-2-BSA免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗MMP-2蛋白的单克隆抗体并予以纯化。通过间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价,并用Westernblot鉴定单克隆抗体的特异性。同时,以人工抗原MMP-2-BSA蛋白为抗原免疫家兔,制备抗MMP-2蛋白的抗血清并予以纯化,制备相应的多克隆抗体,用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价。成功建立人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型后,应用免疫组织化学EnVision法检测MMP-2和P185在裸鼠移植瘤中的表达情况。同时,收集安徽医科大学附属医院1999年1月至2008年12月期间经手术切除的80例卵巢癌组织作为实验组,30例卵巢正常组织作为对照组。应用组织芯片和免疫组织化学EnVision法检测MMP-2和P185蛋白表达情况及其与卵巢癌临床病理特征的关系。
　　结果:
　　1、获得了人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH蛋白;筛选出了能够稳定分泌抗MMP-2单克隆抗体的杂交瘤细胞3G10,其单克隆抗体的亚型经鉴定为IgG1,抗体的效价在106以上。
　　2、MMP-2和P185在裸鼠移植瘤中均呈强阳性表达。MMP-2在卵巢癌组织中的阳性表达率为73.75％(59/80),在正常组织中的阳性表达率为13.3%(4/30),差异具有显著性(P<0.01)。MMP-2的表达在组织学类型之间无显著性差异(P>0.05),而与卵巢癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05~P<0.01)。P185在卵巢癌组织中的阳性表达率为77.5%(62/80),在正常组织中的阳性表达率为20%(6/30),差异具有显著性(P<0.01),P185的表达在组织学类型之间无显著性差异(P>0.05),而与卵巢癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05~P<0.01)。在卵巢癌组织中MMP-2和P185蛋白的表达呈显著正相关,相关系数r=0.38(P<0.01)。
　　结论:
　　1、合成了人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH,并制备了抗人MMP-2的单克隆抗体。
　　2、MMP-2和P185蛋白在人卵巢癌中表达水平明显增高,均与卵巢癌的组织病理分级、临床分期以及淋巴结转移均有关,提示MMP-2和P185蛋白高表达在卵巢癌的发生、分化、进展过程中起重要的作用,可以作为判定卵巢癌生物学行为和预后的指标,对指导卵巢癌的分子靶向治疗具有重要意义。
　　3、MMP-2和P185蛋白在卵巢癌中表达呈正相关,二者共同作用可能在卵巢癌的发生发展过程中起协同作用。

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英文摘要

[第一部分]抗人MMP-2单克隆抗体的制备

1 前言

2 材料与方法

2.1 常用仪器

2.2 MMP-2人工抗原的合成

2.3 MMP-2人工抗原的鉴定

2.5 抗MMP-2多克隆抗体的制备

3 结果

3.1 人工抗原MMP-2-KLH的间接ELISA鉴定（图1）。

3.2 人工抗原MMP-2-BSA的间接ELISA鉴定（图2）。

3.3 人工抗原MMP-2-BSA的SDS-PAGE鉴定（图3）。

3.4 MMP-2-BSA蛋白浓度测定（图4）。

3.5 MMP-2-KLH蛋白浓度测定（图5）。

3.6 细胞融合的融合率、阳性率

3.8 单克隆抗体的亚类分析（图7）。

3.9 小鼠腹水及纯化后腹水的电泳比较（图8）。

4 讨论

5 结论

[第二部分]应用组织芯片技术研究卵巢癌中MMP-2和P185的表达和临床意义

1 前言

2 材料与方法

2.1 临床资料

2.2 常用仪器

2.3 试剂

2.4 动物和细胞株

2.5 动物试验所需器械

2.6 动物模型的建立

2.7 HE染色

2.8 免疫组化染色

2.9组织芯片的构建

3 结果

3.1裸鼠移植瘤肿瘤的病理学特点

3.2 裸鼠移植瘤组织中MMP-2和P185蛋白的免疫组化检测

3.3 MMP-2蛋白在卵巢癌组织及非癌组织中的表达

3.4 P185蛋白在卵巢癌组织及非癌组织中的表达

3.5卵巢癌中MMP-2蛋白的表达与临床病理参数的关系

3.6 卵巢癌中P185表达与临床病理参数的关系

3.7卵巢癌中MMP-2和P185蛋白的表达的相关性

4 讨论

4.1 组织芯片及免疫组织化学技术的应用效果及意义

4.2 MMP-2和P185蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况

4.3 MMP-2的表达与卵巢癌的关系

4.4 P185的表达与卵巢癌的关系

5 结论

参考文献

致谢

附录

综述