硫化氢介导的大鼠大脑中动脉的EDHF舒张反应及其在脑缺血再灌注过程中的变化

摘要

生理状况下,血管内皮通过生成和释放内皮源性的舒张因子,如一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列环素(prostacyclin,PGI2)及内皮源性超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF),在维持血管稳态方面起着重要的作用。它们和内皮素﹑血栓素A2(TXA2)等血管收缩因子共同作用,调节血管局部的紧张程度和血流量,其中NO和PGI2发现较早,其性质和作用机制均得到广泛而且深入的研究,但有关EDHF,尤其是EDHF在脑血管中的作用研究还很少。
　　硫化氢(H2S)长期以来一直是被看成是对机体有害的气体分子。研究表明H2S是机体气体信号家族中的重要的一员,与NO、一氧化碳(CO)一起被称为“三人执政”。在哺乳动物细胞中,合成H2S的酶主要有胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)。现普遍认为CSE是心血管系统中产生H2S的唯一的酶。在血管中,CSE不仅在血管平滑肌细胞中表达,在血管内皮细胞中也有表达。本文现对H2S在大鼠大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)中是否具有EDHF样作用进行了研究。
　　目的:
　　1.探讨H2S是否介导大鼠MCA中EDHF舒张反应。
　　2.探讨脑缺血再灌注大鼠MCA中EDHF舒张反应的变化。
　　方法:
　　1.采用离体血管舒缩功能测定实验方法,检测乙酰胆碱(ACh)﹑硫氢化钠(NaHS)、L-半胱氨酸(L-Cys)等对大鼠离体MCA的舒张作用,并分别观察四乙胺(TEA,1×10-3mol/L)对NaHS舒张大鼠MCA作用的影响及去内皮和DL-炔丙基甘氨酸(PPG,1×10-4mol/L)对L-Cys舒张大鼠MCA作用的影响。血管用一氧化氮(NO)合酶抑制剂(L-NAME,3×10-5mol/L)和前列环素(PGI2)合酶抑制剂(Indo,1×10-5mol/L)预处理后,用ACh诱导血管产生非NO、非PGI2舒张反应,并分别观察TEA(1×10-3mol/L)或PPG(1×10-4mol/L)对这种非NO、非PGI2舒张反应的影响。
　　2.运用胶原酶Ⅱ等消化大鼠MCAs获取混合细胞悬液,磁珠分离法(magnetic cell separation system)分离纯化大鼠MCAs内皮细胞,采用RT-PCR的方法检测正常大鼠MCAs内皮细胞中内源性H2S合酶—CSEmRNA的表达。
　　3.采用线栓法复制局灶性脑缺血(MCAO)再灌注损伤模型,观察大鼠神经功能缺陷,检测脑梗死体积和脑组织中H2S含量的变化及EDHF介导的血管舒张反应的变化。并用RT-PCR的方法检测脑缺血再灌注过程中CSEmRNA的表达的变化。
　　结果:
　　1.在KCl(30mmol/L)预收缩的大鼠MCA环上,ACh(10-7~10-4.5mol/L)可浓度依赖性舒张大鼠MCA,血管用L-NAME(3×10-5mol/L)和Indo(10-5mol/L)预处理后,ACh对MCA仍具有舒张作用。但钙激活钾通道(KCa通道)阻断剂四乙胺(TEA,1×10-3mol/L)或CSE(内源性H2S合酶)抑制剂PPG(1×10-4mol/L)可明显取消这种MCA的舒张。NaHS(10-5~10-2.5mol/L,H2S供体)也可浓度依赖性舒张MCA,但可被1×10-3mol/LTEA显著地抑制;L-Cys(10-5~10-2.5mol/L,CSE底物)也可诱导MCA舒张,但PPG(1×10-4mol/L)或去除血管内皮可显著抑制L-Cys的这种舒张作用。。
　　2.采用磁珠分离法分离纯化得到大鼠MCAs内皮细胞,运用RT-PCR的方法检测结果显示大鼠MCAs内皮细胞上有CSEmRNA条带的表达。
　　3.在脑缺血再灌注损伤中,大鼠MCA中EDHF介导的舒张反应明显增强,大鼠MCA内皮细胞中CSEmRNA表达上调,大鼠脑组织H2S含量显著增多。
　　结论:
　　1.在大鼠MCA中,ACh诱导的非NO、非PGI2舒张反应,即EDHF反应可能是H2S介导的。
　　2.脑缺血再灌注大鼠MCA中EDHF介导的舒张反应明显增强。

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英文缩略词表（abbreviation）

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1.前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 药品与试剂

2.3 仪器与设备

3 实验方法

3.1 离体血管舒缩功能测定实验[22-23]（动脉加压灌注法）

3.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型

3.3局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中H2S含量的测定[27]

3.4 磁珠法分离纯化大鼠MCA内皮细胞[28-31]

3.5 RT-PCR方法检测内皮细胞中CSE的表达

3.6 统计学处理

4 实验结果

4.1 H2S与EDHF介导的大鼠MCA的舒张反应的关系

4.2 大鼠MCA的内皮细胞中CSEmRNA的表达

4.3 脑缺血再灌注大鼠MCA中EDHF介导反应的变化

5 讨论

5.1大鼠MCA中的EDHF介导的舒张反应

5.2 H2S与大鼠MCA中EDHF血管舒张作用的关系

5.3 脑缺血再灌注大鼠MCA中EDHF舒张反应的变化

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述