Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用及SEDL基因突变致迟发性骨骺发育不良机制的初步研究

摘要

目的：运用酵母双杂交技术研究Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用区域;构建Depp蛋白及Depp蛋白N端C端缺失突变体和Sedlin蛋白的真核表达载体,共同转染至COS7细胞,分别观察在哺乳动物细胞中的共定位情况;构建Sedlin蛋白四个点突变体D47Y,S73L,F83S,V130D到pcDGFP真核载体中转染到COS7细胞中观察单转定位情况与野生型的差别,分别再与带Flag标签的Depp蛋白共同转染至COS7细胞观察共定位情况。构建带GFP标签的Depp蛋白与带Flag标签的Sedlin蛋白共同转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内Depp蛋白与Sedlin蛋白能否相互作用。
　　方法：以pACT2-Depp为模板,PCR扩增Depp蛋白N端300bp和C端339bp的DNA片段,分别将片段插入到pGADT7载体中,构建Depp缺失突变体pGADT7-Depp-N300和pGADT7-Depp-C339。将两种缺失突变体分别与pGBKT7-SEDL共同转化酵母菌AH109感受态细胞,SD培养基(﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT)/X-α-gal上生长筛选蓝色,呈蓝色的克隆是X-α-gal活性为阳性克隆;以pGBKT7-SEDL为模板,用定点突变的方法分别扩增出BD-SEDL-D47Y,S73L,F83S,V130D。分别与pGADT7-Depp共同转化酵母菌AH109感受态细胞,筛选蓝色克隆。
　　以pGBKT7-SEDL为模板,PCR扩增Sedlin蛋白全长编码序列,目的片段经BamHI和EcoRI酶切后回收,回收片段插入到带GFP标签的载体中,构建表达载体pcDGFP-SEDL及四个点突变体,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞的定位与野生型的差别,再分别与带Flag标签的Depp蛋白共同转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察共定位情况;PCR扩增Sedlin编码序列,扩增产物插入到带Flag标签的pCDNA3.1载体中,构建真核表达载体pCDNA-FLAG-SEDL。通过酶切和测序鉴定后,将质粒pCDGFP-Depp和pCDNA-FLAG-SEDL共同转染COS7细胞,通过免疫荧光的方法观察Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的共定位情况;共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过Westernblot检测在哺乳动物细胞内Depp蛋白与Sedlin蛋白能否结合。
　　结果：经酶切和测序鉴定,各重组质粒均构建正确。通过营养筛选及α-半乳糖苷酶活性的测定标明Depp蛋白的N端和C端都能和Sedlin蛋白相互作用,Sedlin蛋白点突变体只有D47Y呈阳性,其他三个点突变是阴性;免疫荧光显微镜观察实验观察到Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中共同集中分布于细胞核周区域,且N端共定位和野生型相似;Sedlin蛋白的四个点突变体和Flag-Depp蛋白共同转染至COS7细胞中,表明GFP-SEDL-D47Y共定位和野生型分别相似,在核周核内都有分布,而S73L,F83S,V130D主要共定位于核周。Westernblot检测显示Depp蛋白和N端均表达,而C端未见表达;免疫共沉淀和Westernblot检测证明Depp蛋白和Sedlin蛋白能在HEK293T细胞中相互结合。
　　结论：Depp蛋白与Sedlin蛋白相互作用关键区域位于其N端300bp编码100个氨基酸的片段内;免疫荧光实验说明Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中集中共定位于细胞核周围区域,提示Depp蛋白和Sedlin蛋白在细胞内的相互作用。Sedlin蛋白点突变体单转定位和双转定位表明,D47Y在细胞定位和野生型相似,而S73L,F83S,V130D定位主要分布在核周;免疫共沉淀实验表明Depp蛋白和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞质能相互结合;

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Depp蛋白与Sedlin蛋白的相互作用及SEDL基因突变致迟发性骨骺发育不良机制的初步研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 主要材料

2.2 主要试剂

2.2.1 培养液/基

2.2.2 细菌质粒提取与电泳

2.2.3 细菌感受态细胞的制备

2.2.4 酵母双杂交

2.2.5 细胞培养

2.2.6 免疫荧光及免疫沉淀

2.2.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.8 蛋白质印迹

2.2.9 其它

2.3 实验方法

2.3.1 质粒的制备和转化

2.3.2 化学感受态细菌细胞的制备

2.3.3 质粒的构建

2.3.5 细胞的免疫荧光

2.3.6 免疫沉淀

2.3.7 蛋白印迹

3 结 果

3.1 酵母双杂交实验研究 Depp 蛋白、缺失突变体与 Sedlin 蛋白、点突变体相互作用的区域

3.2 Depp蛋白及缺失突变体在哺乳动物细胞内的定位和表达

3.3 Sedlin蛋白点突变体在哺乳动物细胞内的定位和表达。

3.4 免疫共沉淀实验证实Sedlin蛋白和Depp蛋白相互作用

3.5 Depp蛋白及N端缺失突变体和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内的共定位。

3.6 Depp蛋白和Sedlin蛋白4个点突变体在哺乳动物细胞内的共定位。

4 讨论

5 结论

对课题的进一步设想

参考文献

附 录

致谢

综述