免疫共沉淀联合质谱筛选肝核因子HNF3β相互作用蛋白质及初步功能研究

摘要

肝细胞核因子HNF3β是一类在肝脏中富集表达的转录因子,调控多种肝脏基因的组织特异性表达,参与维持肝脏正常的表型与生理功能。敲除HNF3β的小鼠不能形成正常的神经脊索并早期胚胎致死, HNF3β的变异可能与2型糖尿病的发生相关。HNF3β参与糖代谢、脂肪代谢、调控胆酸以及生长相关基因的表达调控。HNF3β在调控基因转录的过程中需要募集多种辅助因子协同发挥作用。对HNF3β相互作用蛋白质的挖掘研究,有助于更深入的探索HNF3β在生命过程中的功能及作用机制。目前有关HNF3β蛋白质间相互作用的报道还相对较少,已知的与HNF3β发挥相互作用的蛋白质只有8个,包括OTX2,SRC1,TLE1,HOXA5,HNF6A,GSC,EN2,LHX1等,它们都参与转录调控。这些数据对于全面的阐明HNF3β蛋白复合体的组成及动态变化还是远远不够的。目前大规模研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交技术,但由于要去除转录激活区,因此并不适用于研究转录因子。免疫共沉淀技术可用于研究生理水平下蛋白质间的相互作用,随着质谱技术的发展,其准确性高与速度快的优点使免疫共沉淀联合质谱分析技术已被广泛应用于寻找生理水平下新的相互作用。
　　本研究对HNF3β相互作用蛋白质进行了分离鉴定,并对LMNA-HNF3β相互作用介导的生物学功能进行了初步的研究。以HNF3β特异抗体免疫沉淀分离HepG2细胞内HNF3β蛋白质复合体,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色,切取与对照组存在差异的条带进行SDS-PAGE胶上蛋白质LTQ质谱鉴定其组成成分。本文通过4次独立重复实验共获得53个相互作用数据,生物信息学分析发现,其中与HNF3β共定位的蛋白质有9个,具有相互作用结构域的的蛋白质有5个,有10个分子同靶蛋白具有相同GO注释,有9个分子与靶蛋白之间存在间接相互作用。基于这些分析结果,挑选其中4个相互作用分子,构建真核表达载体,进行报告基因实验和外源性免疫共沉淀实验的验证。验证了LMNA与HNF3β的相互作用,报道基因实验表明LMNA可以影响 HNF3β的转录活性。免疫共聚焦实验发现LMNA与HNF3β共定位于细胞核,SiLMNA下调HepG2细胞内 LMNA的表达,可以改变 HNF3β下游靶基因的表达。
　　基于这些实验可推测HNF3β可和细胞内多种蛋白质发挥作用,协同参与转录调控,LMNA-HNF3β之间相互作用的实验研究表明它们之间的相互作用可能具有重要的生理意义,并可能在葡萄糖、脂肪代谢及相关疾病的发生、发展中起作用。

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前言

第一部分 免疫共沉淀联合质谱筛选HNF3β相互作用蛋白质及蛋白质相互作用数据评价

1.引言2.材料与方法

3.结果

3.1 免疫共沉淀

3.2 考马斯亮蓝染色

3.3 质谱鉴定CO-IP产物

3.4 质谱数据分析

4.讨论

第二部分 HNF3β相互作用候选蛋白质分子的验证及功能初探

1.引言

2.材料与方法

3.结果

3.1载体的构建3.2基因载体测序结果

3.3 Co-IP验证蛋白质间相互作用

3.4报道基因实验检测相互作用蛋白质对HNF3β 转录活性的影响

3.5激光共聚焦观察HNF3β及相互作用候选分子在细胞内定位

3.6 SiRNA干涉效果的确定

3.7 LMNA干涉后，HNF3β 靶基因的mRNA 水平有不同程度变化

4.讨论

结论

参考文献

附录1 FKH 结构域的相互作用结构域

附录 2基因敲除表型

附录 3 本人简历及在学期间的研究成果

致谢

综述