诱骗性寡核苷酸涂层支架预防血管介入术后再狭窄的实验研究

摘要

[背景与目的]　　 近年来由于药物洗脱支架的发明和完善,冠状动脉支架内再狭窄的发生率明显降低,但实验表明雷帕霉素等经典涂层药物在抑制新生内膜平滑肌细胞过渡增殖的同时,也抑制了内皮细胞的修复,从而易导致晚期血栓的形成,再次梗塞发生率增加。寻找特异性高的生物制剂一既选择性抑制平滑肌细胞的增生,又加强内皮细胞的修复,成为许多研究者的奋斗目标。　　 诱骗性寡核苷酸主要通过竞争性与核转录因子结合,从而阻碍其与下游基因启动子或增强子核心序列结合,达到降低下游基因表达的目的。众多研究已经证明该方法是一种有潜力的分子治疗手段。目前转录因子E2F和NFkB诱骗性寡核苷酸已广泛应用于体外移植血管阻塞等疾病的防治研究,且有实验结果表明:其对血管内皮细胞的修复无明显抑制作用,为支架内再狭窄的预防带来了新的曙光。　　 但既往诱骗性寡核苷酸研究多采用局部灌注或体外浸泡等一过性转染方式,限制了其疗效,所以本研究以明胶涂层支架为载体,将转录因子E2F和NF k B的诱骗性寡核苷酸运送至冠脉局部,旨在评价其作为预防支架内再狭窄的生物制剂的潜在价值。　　 [方法]　　 1.采用组织块贴壁法原代培养小型猪胸主动脉平滑肌细胞,EMSA法筛选与小型猪细胞具有特异性亲和能力的诱骗性寡核苷酸序列,流式细胞仪及共聚焦扫描仪法筛选合适的体外转染试剂,确定脂质体为原代培养平滑肌细胞的合适转染载体。　　 2.以阳离子脂质体Lipofectamine2000为寡核苷酸载体,预转染原代培养的小型猪胸主动脉平滑肌细胞,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测NFkB和E2F的诱骗性寡核苷酸对平滑肌细胞增殖的抑制作用；流式细胞仪检测其对细胞周期及细胞凋亡的影响；蛋白印迹实验评价其对平滑肌细胞与增殖相关的蛋白PCNA和与凋亡相关的蛋白Caspase3表达的影响。　　 3.采用RT-PCR及ELISA法检测MMP-9及TIMP-1、MCP-1在mRNA及蛋白水平的表达情况,明确诱骗性寡核苷酸单独或联合作用对炎症相关因子的影响。　　 4.建立小型猪冠状动脉支架植入术后再狭窄模型,与微创公司联合研制诱骗性寡核苷酸-明胶涂层支架。造模4周后,取支架段血管切片,进行病理形态学分析,用扫描电镜观察血管内皮修复情况,并用RT-PCR方法检测局部血管组织中VEGF,NFkB,MCP-1,MMP-9,MMP-2,TIMP-1 mRNA表达水平,探讨诱骗性寡核苷酸涂层支架预防再狭窄的分子机制。　　 [结果]　　 1.原代培养小型猪胸主动脉平滑肌细胞,EMSA法确定转录因子NFkB和E2F-1诱骗性寡核苷酸序列,流式细胞仪及共聚焦扫描仪法表明Lipofectamine2000转染平滑肌细胞具有较高的细胞核内转染效率。　　 NFkB诱骗性寡核苷酸:5’AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3’,　　 5’GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T3’。　　 NFkB错配寡核苷酸:5’AGT TGA GGC CAC TAA CCC AGG C3’,　　 5’GCC TGG GTT AGT GGC CTC AAC T3’。　　 E2F诱骗性寡核苷酸:5’CTA GAT TTC CCG CG3’,　　 5’GAT CCG CGG GAA AT3’。　　 E2F错配寡核苷酸:5’CTA GAT TTC GAG CG3’,　　 5’GAT CCGCTC GAA AT3’。　　 2.四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测结果表明:10％胎牛血清刺激24小时后,与正常对照组和相应的错配寡核苷酸组比较,NFkB3诱骗性寡核苷酸组、E2F诱骗性寡核苷酸组和NFkB+E2F诱骗性寡核苷酸联合组(半量联合,1/2+1/2)均可明抑制平滑肌细胞增殖(34.96±6.35％,38.75±0.14％,49.60±5.07％),NFkB+E2F诱骗性寡核苷酸联合组(1/2+1/2)抑制平滑肌细胞增殖的作用强于两种诱骗性寡核苷酸单独应用组,P值均小于0.01。10％胎牛血清作用24小时后流式细胞仪分析表明:预转染NFkB和/或E2F诱骗性寡核苷酸的平滑肌细胞G0/G1期细胞百分数增加,S期和G2/M期细胞百分数降低；预转染NFkB和/或E2F诱骗性寡核苷酸的平滑肌细胞早期凋亡百分率明显增加。蛋白印迹实验结果表明:NFkB和E2F诱骗性寡核苷酸单独作用组及其联合作用组(1/2+1/2)其平滑肌细胞PCNA蛋白表达水平明显降低,Caspase3蛋白表达水平明显增加。　　 3.RT-PCR实验结果表明:在10％胎牛血清刺激12小时后,与正常对照组和错配寡核苷酸组比较,NFkB诱骗性寡核苷酸组和NFkB+E2F诱骗性寡核苷酸联合作用组(1/2+1/2)MCP-1 mRNA表达水平明显降低；在10％胎牛血清刺激48小时后,与错配寡核苷酸对照组比较,NFkB诱骗性寡核苷酸组和NFkB+E2F诱骗性寡核苷酸联合作用组(1/2+1/2)其MMP-9的mRNA表达水平明显降低；E2F诱骗性寡核苷酸组无此变化。诱骗性寡核苷酸组和错配寡核苷酸组其TIMP-1mRNA表达水平无明显差异。ELISA结果表明:10％胎牛血清刺激24小时后,预转染NFkB诱骗性寡核苷酸的平滑肌细胞MCP-1蛋白表达水平明显降低。　　 4.小型猪冠状动脉支架植入术后4周,病理形态学结果表明:与明胶涂层支架对照组比较,E2F诱骗性寡核苷酸涂层支架组新生内膜面积、面积狭窄百分比及内膜面积/中膜面积比值均明显降低(1.28±0.72,0.38±0.20,0.40±0.12；4.04±0.82,0.82±0.13,0.67±0.09)(P<0.05),NF k B诱骗性寡核苷酸涂层支架组和NF k B+E2F诱骗性寡核苷酸涂层支架(1/2+1/2)组与相应的对照组比较上述指标无明显变化。扫描电子显微镜观察发现:NFkB和/或E2F诱骗性寡核苷酸涂层支架组其血管内皮细胞覆盖面积明显大于明胶涂层支架对照组。RT-PCR结果观察到:与明胶涂层支架对照组比较,E2F诱骗性寡核苷酸涂层支架、NFkB诱骗性寡核苷酸涂层支架及NFkB+E2F诱骗性寡核苷酸联合涂层支架(1/2+1/2)其MMP-9 mRNA几乎不表达,而TIMP-1 mRNA表达水平无明显差别,其它如VEGF,NFkB,MCP-1 mRNA表达水平亦无明显差别。　　 [结论]　　 1.对于原代培养的血管平滑肌细胞,转录因子NF k B和E2F的诱骗性寡核苷酸单独或联合(1/2+1/2)应用均可阻滞细胞周期进程、诱导细胞凋亡,从而抑制细胞增殖,并且NF k B诱骗性寡核苷酸具有抑制炎症因子表达的作用。　　 2.转录因子NF k B和E2F的诱骗性寡核苷酸涂层支架植入小型猪冠状动脉4周后,E2F诱骗性寡核苷酸可预防支架内再狭窄；E2F和NF k B的诱骗性寡核苷酸均具有促进内皮细胞修复的作用；NF k B诱骗性寡核苷酸单独或和E2F诱骗性寡核苷酸联合(1/2+1/2)未见明显预防支架内再狭窄作用。　　 3.E2F诱骗性寡核苷酸涂层支架可作为预防冠脉支架内再狭窄的,有前景的研究方

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 诱骗性寡核苷酸序列及血管平滑肌细胞转染载体的筛选

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 诱骗性寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 诱骗性寡核苷酸对血管平滑肌细胞炎症反应的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分 诱骗性寡核苷酸涂层支架对冠脉介入术后再狭窄的预防作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

缩略词表

发表文章