舒尼替尼联合多西他赛序贯给药作用于EGFR-TKIs抵抗的非小细胞肺癌协同机制的研究

摘要

研究背景:肺癌已经成为肿瘤相关性死亡的主要原因,成为威胁生命和世界健康的严重问题。在所有的肺癌中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌的80-85％。然而,大多数患者在就诊时已属于晚期。对于这部分患者,药物治疗成为一种重要的治疗方式。吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)是小分子的表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂(epidermal growth factor receptor–tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs),它能通过阻断肺癌生长和恶性进展的关键信号通路而明显改善患者的生存。研究显示,EGFR激活突变与EGFR-TKIs的反应率直接相关,但仅有约10-30%肺癌患者拥有EGFR激活突变。对于出现K-ras或EGFR T790M突变的患者则表现出对EGFR-TKIs的耐药。小分子的舒尼替尼(Sunitinib)是口服的、选择性多靶点的受体酪氨酸酶抑制剂,它可以抑制一些生长因子受体包括血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR1/2/3)、血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR-α,PDGFR-β)、干细胞生长因子受体(stem cell factor receptor,c-kit)和胶质细胞源性神经营养因子受体(glial cell-line-derived neurotrophicfactor receptor,RET)。Sunitinib一方面可以通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)介导的细胞增殖和生存信号通路显示出直接的抗肿瘤效应,另一方面通过抑制VEGFR和PDGFR阻断新生血管的形成而表现间接的抗肿瘤作用。先前的临床前和临床试验结果已经证实Sunitinib在许多肿瘤中表现出抗肿瘤效应。目前,序贯治疗正作为一种非常有前景的治疗方式被研究,在NSCLC中EGFR-TKIs和化疗的序贯也正在被研究。因此,值得探索Sunitinib序贯化疗在治疗K-ras或EGFR T790M突变的NSCLC。
　　目的:先前的研究已经显示Sunitinib对NSCLC具有抗肿瘤作用。本研究旨在探索Sunitinib单药及联合多西他赛(Docetaxel)不同给药顺序对EGFR-TKIs抵抗的非小细胞肺癌细胞株的效应。
　　方法:EGFR T790M和K-ras突变的NSCLC经过Sunitinib和Docetaxel单药以及二者不同给药顺序处理后,MTT法检测细胞的存活率,流式细胞术检测不同方式作用后的细胞周期变化,Western Blot检测不同给药顺序信号通路水平的变化。
　　结果:Sunitinib显示出浓度依赖的生长抑制作用,并且阻滞细胞于G1期;而Docetaxel阻滞细胞于S期。尽管单药或同时使用有一定的抗增殖作用,但二药的序贯则显示出明显的抗肿瘤作用。当细胞经过先用Docetaxel后用Sunitinib方式处理后,可观察到二药的协同效应。这种协同机制的分子基础可能是初始的Docetaxel作用后下游的信号通路被激活,然后被后用Sunitinib有效的抑制。相反,以相反的处理顺序则导致拮抗,这可能部分归因于二药对细胞周期的不同作用导致。
　　结论:本研究论证了在EGFR-TKIs抵抗的NSCLC中,单药Sunitinib以及Sunitinib和Docetaxel存在序贯依赖的增殖抑制作用。发现了Sunitinib单药对EGFR-TKIs抵抗的NSCLC显示出显著的增殖抑制作用。并且,在NSCLC中不论EGFR和K-ras的突变状态,先用Docetaxel后用Sunitinib的序贯方式是一种优化的治疗方式。基于以上的发现,在临床上值得进一步探讨Sunitinib单药或是序贯传统化疗药物治疗EGFR-TKIs抵抗的NSCLC。然而,在体外研究中发现,Sunitinib的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)明显高于在体内所获得的血药浓度。因此,需要通过进一步的体内实验,探讨Sunitinib单药或是序贯Docetaxel治疗EGFR-TKIs抵抗的NSCLC。

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1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 细胞系

2.1.2 药物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要试剂的配制：

2.1.5 主要仪器与耗材：

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 细胞形态的观察

2.2.3 体外 MTT细胞增殖抑制试验

2.2.4 Annexin V-EGFP荧光染色观察细胞凋亡

2.2.5 流式细胞术检测不同顺序给药对A549和H1975细胞株细胞周期的影响

2.2.6 Western Blot检测不同顺序给药对A549细胞下游信号通路蛋白表达的影响

2.2.7 统计学分析

3 结果

3.1 体外Sunitinib单药对A549（K-ras突变EGFR野生型）和H1975（K-ras野生型EGFR T790M突变）细胞的增殖抑制作用

3.1.1 Sunitinib对A549细胞体外增殖的影响

3.1.2 Sunitinib对H1975细胞增殖抑制作用 MTT法检测0.75、1.5、3.0、6.0、

3.2 体外单药Docetaxel对A549和H1975细胞的增殖抑制作用

3.3 体外舒尼替尼和多西他赛序贯和联合作用对 A549 和H1975 细胞的增殖抑制率和各组CI值

3.4 Sunitinib对A549和H1975细胞凋亡形态的影响

3.5 Sunitinib和Docetaxel单药和序贯用药对A549和H1975细胞周期的影响

3.6 Docetaxel激活下游的生存信号通路

3.7 Sunitinib和Docetaxel单药和序贯用药对A549细胞下游信号通路表达的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述