Aurora B拮抗剂通过序贯给药协同增强顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的药效及其机制研究

摘要

目的：卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，在中国的发病率呈逐年上升的趋势，严重危害女性的生命健康。铂类化疗药如顺铂是许多卵巢癌患者临床化疗的首选药物。但有数据表明，75％的患者在化疗后期对顺铂的敏感性下降，从而导致卵巢癌治疗失败。因此，寻找治疗顺铂耐受卵巢癌的全新化疗方案就显得尤为重要。有文献报道，处于多倍体状态的急性淋巴白血病细胞和黑色素瘤细胞对细胞毒类化疗药阿糖胞苷和顺铂表现出了更高的敏感性。但卵巢癌细胞是否具有类似的现象仍有待探究。极光激酶B(Aurora B)是一个负责调控细胞有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸激酶。抑制Aurora B将会导致染色体校准功能的受损以及细胞有丝分裂检测点功能的丧失，从而诱导细胞出现多倍体阻滞和凋亡。同时，和正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中大量表达Aurora B，提示Aurora B可能与卵巢癌的发生发展相关。有文献报道，Aurora B的拮抗剂与原癌基因c-Myc存在合成致死效应，即细胞的c-Myc水平能够调控细胞对Aurora B拮抗剂的敏感性，但c-Myc水平与顺铂药效之间的关系尚无明确报道。因此，本课题将研究AuroraB拮抗剂AZD1152与顺铂合用在卵巢癌中的抗肿瘤活性，并探讨c-Myc在其中发挥的作用及相关的分子机制。
　　方法：选用人卵巢癌细胞株OVCAR-8、 ES-2、A2780、SKOV3作为研究对象，考察AZD1152（Aurora B拮抗剂）与顺铂在不同给药方案中的合用效果以及细胞凋亡水平。采用SRB法检测药物在卵巢癌细胞株上的IC50;采用PI单染结合流式细胞术分析细胞周期的变化及细胞的凋亡比例;采用AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞术验证细胞凋亡的发生;采用DAPI染色法观察给药前后卵巢癌细胞中凋亡小体的产生情况;采用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(PARP、Caspase3、Caspase8、CleavedCaspase3)和细胞周期相关蛋白(p21)的表达水平;采用Real-time PCR检测细胞内周期相关因子p21的mRNA表达水平。选用人卵巢癌细胞株OVCAR-8、A2780、SKOV3，骨肉瘤细胞株KHOS、U2OS，非小细胞肺癌细胞株H460、NCI-H1299，前列腺癌细胞株PC3，膀胱癌细胞株5637，乳腺癌细胞株MDA-MB-468为研究对象，考察原癌基因c-Myc在AZD1152与顺铂序贯合用中所发挥的作用。采用SRB法检测AZD1152与顺铂在不同细胞株中的序贯合用效果，并计算合用指数(CI);采用SiRNA技术沉默OVCAR-8细胞c-Myc的表达;采用慢病毒转染技术在SKOV3细胞中过表达c-Myc;采用PI单染结合流式细胞术分析细胞周期的变化情况及细胞的凋亡比例;采用Western blot检测c-Myc、Aurora B、p-Histone H1的蛋白表达量。
　　结果：⑴通过SRB法检测了四株不同卵巢癌细胞对AZD1152和顺铂的药物敏感性，发现OVCAR-8细胞对顺铂最耐受，但对AZD1152最敏感;SKOV3细胞与OVCAR-8细胞正好相反，A2780细胞对两药的敏感性适中，恶性程度较高的ES-2细胞对AZD1152的敏感性与OVCAR-8类似，并且对顺铂也表现出了一定程度的耐受。PI单染结合流式细胞术也证实AuroraB拮抗剂可不同程度地诱导OVCAR-8、SKOV3、ES-2细胞发生多倍体阻滞。其次，我们在卵巢癌细胞株中同时给予或序贯给予AZD1152和顺铂，评价不同给药方式下药物的合用效果。结果显示，两药同时给予OVCAR-8细胞和ES-2细胞时，合用效果不明显;而在序贯给药方式下，AZD1152可以显著增加顺铂的抗肿瘤活性，并且两药合用可显著上调细胞周期因子p21的转录和翻译水平。与此同时，AZD1152与卡铂的序贯合用也可协同抑制卵巢癌细胞的增殖，但AZD1152与紫杉醇在多种合用方案中均不存在协同效果。⑵通过DAPI染色观察AZD1152与顺铂合用后细胞核形态的变化，结果显示，在序贯给药方式下，AZD1152与顺铂合用引起OVCAR-8细胞和ES-2细胞的细胞核碎裂成大小不等的圆形小体，提示可能发生凋亡。采用PI单染结合流式细胞术检测细胞凋亡比例，发现AZD1152通过序贯给药显著增强了顺铂诱导的OVCAR-8细胞凋亡，凋亡比例从两药单用的19.17％和27.86％增加至合用后的71.34％。但是当两药同时作用于OVCAR-8细胞时，则无协同效果。随后，采用Western blot检测凋亡相关蛋白PARP、Caspase3、Caspase8、CleavedCaspase3的表达水平，进一步证实了以上结论。⑶通过SRB法检测了AZD1152与顺铂的序贯合用在以顺铂作为一线化疗药的不同肿瘤细胞株中的合用效果。通过计算CI值可知，两药的序贯合用在骨肉瘤细胞株KHOS和U2OS、非小细胞肺癌细胞株NCI-H1299、膀胱癌细胞株5637、前列腺癌细胞株PC3中表现出较良好的合用效果，但在乳腺癌细胞株MDA-MB-468和非小细胞肺癌细胞株H460中无协同效果。进一步研究发现，原癌基因c-Myc在合用效果良好的细胞株中呈现不同程度的高表达，而在无合用效果的细胞株中几乎不表达。以上结果提示，c-Myc的表达水平可能与细胞对AZD1152与顺铂序贯合用的敏感性相关。⑷采用SiRNA技术敲低OVCAR-8细胞中的c-Myc表达量，或采用慢病毒转染技术在SKOV3细胞中过表达e-Myc，通过SRB法检测AZD1152与顺铂在上述各卵巢癌细胞株中的序贯合用效果。结果显示，与OVCAR-8相比，AZD1152与顺铂的序贯合用效果在敲除了c-Myc的OVCAR-8细胞中变差;与SKOV3相比，AZD1152与顺铂的序贯合用效果在过表达了e-Mye的SKOV3细胞中变好，这进一步确证c-Myc的表达水平与合用效果相关。⑸PI单染结合流式细胞术显示，在AZD1152诱导下，c-Myc敲除的OVCAR-8细胞形成的多倍体细胞的比例低于正常的OVCAR-8细胞;而c-Myc高表达的SKOV3细胞中的多倍体细胞的比例高于正常的SKOV3细胞，提示c-Myc正性调控AZD1152诱导卵巢癌细胞形成多倍体的能力。进一步研究显示，该调控作用是通过调节Aurora B的底物Histone H1的磷酸化水平而实现的。此外，c-Myc的表达量与卵巢癌细胞对顺铂的敏感性无关。
　　结论：发现Aurora B拮抗剂可以通过序贯给药的方式增敏顺铂在卵巢癌细胞中的抗肿瘤活性，但Aurora B拮抗剂与顺铂同时给药的合用增敏效果不明显。原癌基因c-Myc通过影响Aurora B拮抗剂诱导卵巢癌细胞形成多倍体的能力正性调控序贯合用的效果。本研究不仅提供了克服卵巢癌细胞化疗耐受的新策略，发现Aurora B抑制剂结合传统化疗手段在治疗卵巢癌中的应用前景，而且提出了c-Myc可以作为该联合用药方案的分子标记物，为卵巢癌临床个性化用药提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

2 实验材料与仪器

2．1 细胞株

2．2 药物与主要试剂

2．3 主要仪器

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 SRB染色法测定肿瘤细胞的增殖

3．3 Western blot法检测蛋白表达

3．4 PI单染结合流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡

3．5 Annexin V／PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡

3．6 DAPI染色法观察AZD1152与顺铂合用对细胞核形态的影响

3．7 Real-time PCR测定细胞相关基因表达水平的变化

3．8 SiRNA转染

3．9 慢病毒颗粒的包装及细胞转染

3．10 数据分析

4 实验结果

4．1 不同卵巢癌细胞株对AZD1152和顺铂的敏感性存在差异

4．2 Aurora B抑制剂可通过序贯给药提高顺铂的抗卵巢癌细胞活性

4．3 AZD1152与不同化疗药物合用对卵巢癌的增殖产生不同作用

4．4 AZD1152和顺铂通过序贯合用诱导卵巢癌细胞产生Caspase依赖的凋亡

4．5 不同类型的肿瘤细胞对AZD1152和顺铂序贯合用的敏感性存在差异

4．6 原癌基因c-Myc在AZD1152与顺铂的序贯合用中发挥重要作用

4．7 原癌基因c-Myc通过影响卵巢癌细胞中Aurora B蛋白水平调控AZD1152与顺铂的合用药效

5 讨论

总结与展望

参考文献

综述 铂类耐药卵巢癌的临床治疗与评估研究进展

作者简介及硕士期间科研成果