TRAIL对胃癌耐药细胞株多药耐药基因MDR1,LRP,GST-π表达的干预研究

摘要

研究背景：胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,对于中晚期胃癌来说,化疗仍是综合治疗的重要手段之一,但临床发现许多胃癌患者对化疗药物存在着不同程度的耐受性,即肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象,导致治疗失败。深入研究MDR的发生机制及其影响因素,寻求逆转MDR的对策,对临床提高化疗药物的疗效,改善胃癌患者的预后,具有重要的意义。研究表明:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)不但能选择性的杀伤肿瘤细胞,受病毒等转染细胞以及转化细胞,而且可以增加肿瘤组织对化疗药物的敏感性;TRAIL和化疗药物联合应用能逆转肿瘤耐药细胞为敏感细胞,而对正常细胞几乎无细胞毒性,其具体机制尚不清楚。以TRAIL为靶点逆转肿瘤耐药成为目前这一领域的研究热点。本课题组既往通过免疫组化方法研究发现:在胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中,有多种耐药基因如LRP、GST-π、GCS等表达,通过使用逆转剂后均能使耐药基因表达下调。此次实验拟通过TRAIL干预胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR,检测TRAIL对耐药基因MDR1,LRP及GST-π表达的调节作用,进一步明确TRAIL与耐药基因之间的内在关系。
　　目的:研究TRAIL对胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR多药耐药基因MDR1,LRP及GST-π表达的影响,探讨以TRAIL为靶点逆转胃癌多药耐药的可能机制,为临床以使用TRAIL逆转胃癌耐药提供实验理论依据。
　　方法:用不同浓度的TRAIL(50,100,200,400ug/L)干预胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR培养48h后,同时不加任何干预措施培养SGC7901/VCR细胞株作为对照,RT-PCR法检测各组胃癌耐药细胞株中多药耐药基因MDR1,LRP,GST-πmRNA的表达情况;同时用ELISA法检测各组胃癌耐药细胞株中三种耐药蛋白P-gp,LRP,GST-π的表达含量;并用t检验及单因素方差分析的统计学方法进行分析,研究TRAIL对胃癌耐药细胞株多药耐药基因表达的影响。
　　结果:1)RT-PCR结果:在对照组胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中MDR1,LRP,GST-π三种耐药基因均有表达,其mRNA值分别为0.88±0.01、0.91±0.04、1.01±0.13。经过不同浓度的TRAIL干预胃癌耐药细胞株48h后,TRAIL对MDR1,LRP,GST-πmRNA的表达抑制呈浓度效应关系,但并非线性关系。与对照组相比:MDR1在50,100,200,400μg/L TRAIL组的mRNA值均有明显下降(分别为0.78±0.02vs0.69±0.05vs0.55±0.01vs0.53±0.01,均p<0.01),其中,400μg/L与200μg/L组相比,其抑制程度并不明显(p>0.05),但对照组、50μg/L、100μg/L、200μg/L组相比较, mRNA抑制程度随着浓度的增加均逐渐增加,各组间差异均具有统计学意义(P<0.01);LRP在50,100,200,400μg/L TRAIL组的mRNA值同样均有明显下降(分别为0.85±0.05 vs0.76±0.05 vs0.59±0.04 vs0.58±0.02,均p<0.01),其中,400μg/L与200μg/L组相比,其抑制程度并不明显(p>0.05),但对照组、50μg/L、100μg/L、200μg/L组相比较,mRNA抑制程度随着浓度的增加均逐渐增加,各组间差异均具有统计学意义(P<0.01);GST-π在50,100,200,400μg/L TRAIL组的mRNA值也同样均有明显下降(分别为0.89±0.04vs0.77±0.08vs0.65±0.06vs0.61±0.03,均p<0.01),其中,400μg/L与200μg/L组相比,其抑制程度并不明显(p>0.05),但对照组、50μg/L、100μg/L、200μg/L组相比较,mRNA抑制程度随着浓度的增加均逐渐增加,各组间差异均具有统计学意义(P<0.01)。
　　2)ELISA结果:在对照组中,可以见P-gp,LRP,GST-π蛋白的表达,蛋白含量分别为49.04±2.07 ug/L、119.35±1.04 ug/L、58.62±1.38ug/L;50 ug/L TRAIL组P-gp,LRP,GST-π的含量分别为40.42±1.89ug/L、112.51±1.19ug/L、57.56±1.19ug/L,与对照组相比,含量有所下降(均p<0.01);100ug/L TRAIL组P-gp,LRP,GST-π的含量分别为36.49±0.94ug/L、106.69±1.51ug/L、52.30±0.80ug/L,与对照组相比,含量明显下降(均p<0.01),并且与50ug/L TRAIL组相比,含量也有所下降(均p<0.01);200ug/L TRAIL组P-gp,LRP,GST-π的含量分别为25.15±0.69ug/L、83.54±2.15ug/L、31.41±1.65ug/L,与对照组相比,含量显著下降(均p<0.01),与50ug/L TRAIL组及100ug/L TRAIL组相比,含量也均明显下降(均p<0.01;p<0.01);400ug/L TRAIL组P-gp,LRP,GST-π的含量分别为24.45±1.41ug/L、82.63±1.35ug/L、30.80±1.34ug/L,与对照组相比,含量也显著下降(均p<0.01),与50ug/L TRAIL组、100ug/L TRAIL组相比,含量均明显下降(分别p<0.01;p<0.01),但与200ug/L TRAIL组相比,其蛋白下降含量并不明显,差异不具有统计学意义(均p>0.05)。
　　结论:1:MDR1,LRP,GST-π在胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR中高表达,是引起胃癌继发性耐药的耐药基因。2:本研究结果显示:TRAIL与耐药基因MDR1,LRP,GST-π的表达之间存在负相关的联系。3:从本研究结果推测:TRAIL可能是通过降低耐药基因MDR1,LRP,GST-π在耐药细胞株中的表达,从而参与逆转胃癌的多药耐药。

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1 前言

2 实验材料及实验方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

3.结果

3.1不同浓度TRAIL对SGC7901/VCR细胞MDR1，LRP及GST-πmRNA表达的影响

3.2不同浓度TRAIL对SGC7901/VCR细胞MDR1，LRP及GST-π 蛋白表达的影响（ELISA实验结果）

4.讨论

4.1 TRAIL与胃癌多药耐药

4.2 MDR1与胃癌多药耐药

4.3 LRP与胃癌多药耐药

4.4 GST-π与胃癌多药耐药

5 本研究的不足之处

6结论

参考文献

附录

致谢

综述