体外培养生精细胞的增殖分化效应及显微授精研究

摘要

第一部分 改良培养基对体外培养生精细胞的增殖分化效应
　　目的:通过细胞培养介质的改进探讨新生小鼠睾丸组织生精细胞在体外培养条件下的增殖分化效应,以期提高生精细胞体外存活率,增殖率、分化率及存活时间。
　　方法:对7~8日龄小鼠生精细胞进行混合细胞培养,采用基础培养液(A组)、条件培养液(B组)(基础培养液+20 ng/ml EGF+10 ng/ml GDNF)、分别含浓度为20％、40%、80%睾丸液(testicular abstract,TA)的基础培养液(C1、C2和C3组)和分别含浓度为20%、40%、80%TA的条件培养液(D1、D2和D3组),通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨TA、GDNF和EGF对小鼠生精细胞体外培养增殖分化效应。
　　结果:①形态学观察 对照组和实验组在培养3~4天后均可观察到正在分裂的细胞。B组培养7~8天后可观察到细胞集落,集落间可见散在圆形精子细胞,培养10天后,细胞集落爆发出现,并可见变形精子细胞和带鞭毛精子细胞,培养20天后,可见部分生精细胞和支持细胞凋亡。含TA(C1、C2 和 C3)组和(D1、D2和D3)组细胞生长速度介于A组和B组之间,培养7~8天后也可见少量细胞集落,其中正在分裂细胞偏多,圆形精子细胞少见,培养10天后,细胞集落增加,并可观察到各期生精细胞,但细胞密度低于B组,培养15天后,细胞集落铺满培养皿底部。对实验各组传代培养,A组传代后细胞生长不良,B组传代至2~3代后细胞生长明显减慢,且细胞暗沉发黑、贴壁性差,而C1、C2、C3组和D1、D2、D3组传代培养4个月之后仍可观察到细胞生长。②生精细胞计数 培养各时间阶段B组生精细胞数均显著高于其余组(P<0.05),而A组生精细胞数则显著低于其余各组(P<0.05),其余各组间无显著性差异;③生精细胞存活率 培养第5、10和15天A与B组间细胞存活率无显著性差异,但培养第20天A组细胞存活率显著低于B组(P<0.05),其余组在培养各阶段与A、B组相比细胞存活率无显著性差异;④TP1/P19 A组在培养15天时TP1/P19显著高于B组(P<0.05),B组在培养20天时显著高于其余组(P<0.05),其余各培养组均无显著性差异;⑤单倍体精子细胞比例 B组在培养第15天和20天时单倍体细胞比显著高于其余组(P<0.05),其余各培养组均无显著性差异。
　　结论:在生精细胞与支持细胞混合培养体系中,基础培养液中添加适量GDNF和EGF可显著提高生精细胞体外培养的增殖分化效应,但不能延长其体外培养时间;基础培养液中加入适量TA,可增加生精细胞体外培养的细胞数及时间;在含最佳浓度细胞因子培养液中加入适量TA,降低生精细胞体外培养增殖分化效应,但显著增加生精细胞体外培养的时间。
　　第二部分 体外培养生精细胞的显微授精研究
　　目的:对体外培养获得的圆形和长形精子细胞行卵胞浆内显微注射术(round spermatid injection,ROSI;elongated spermatid injection,ELSI),观察其受精率、卵裂率、桑囊胚形成率,探讨体外培养所获单倍体精子细胞的受精能力以及受精后胚胎的发育潜能。
　　方法:对7~8日龄小鼠生精细胞混合细胞体外培养后获得的圆形/长形精子细胞和成年小鼠睾丸内的圆形和长形精子细胞以及成熟精子进行卵胞浆内显微授精,比较其受精率、卵裂率及桑囊胚形成率。
　　结果:成年小鼠睾丸内单倍体精子细胞和体外培养获得的单倍体精子细胞行ROSI/ELSI后,前者4-8细胞及桑囊胚形成率高于后者,但两组间受精率、卵裂率及桑囊胚形成率均无显著性差异。成熟精子ICSI的受精率、卵裂率、4-8细胞及桑囊胚形成率均显著高于两组ROSI。
　　结论:体外培养所获单倍体精子细胞的受精能力与成年小鼠睾丸内的精子细胞无显著性差异,但前者的胚胎发育潜能略低于后者。成熟精子的显微授精能力及胚胎发育潜能显著高于两组单倍体精子细胞。

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引 言

第一部分改良培养基体外培养生精细胞的增殖分化效应

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 结论

第二部分体外培养生精细胞显微授精研究

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

附 录

致谢

综述一

综述二