雌激素浓度对于髁突软骨细胞中雌激素受体mRNA表达的影响

摘要

目的:颞下颌关节髁突特发性吸收(ICR)是一种多发于青春期女性的髁突渐进性、不明原因的吸收伴前牙开颌、下颌后缩所致的严重的面部畸形。现有的研究发现ICR的患者均出现雌激素水平降低,但同样是雌激素水平低下的骨质疏松症却是全身性骨骼疾病,而ICR只发生在髁突。也就是说,迄今学术界尚无法解释ICR的患者不出现像骨质疏松症一样的全身性骨骼疾病,而只在髁突发生特异性吸收这一现象。研究已证实人的颞下颌关节中存在雌激素受体,即髁突软骨是雌激素的靶器官之一。推论:只发生在髁突吸收的这种特异性现象可能与髁突软骨中存在雌激素受体有某种潜在的关联。基于此,本研究拟以雌激素受体为切入点,试图通过半定量研究雌激素浓度对于髁突软骨细胞中雌激素受体mRNA表达的影响,揭示雌激素及其受体对髁突特发性吸收发病的影响,从而对颞颌关节髁突特发性吸收的发病机制做出科学的解释。
　　方法：实验材料取自3周龄的SD大鼠,脱颈处死后,在无菌条件下收集髁突软骨,用胰酶和II型胶原酶联合消化后分离培养髁突软骨细胞。将获得的的髁突软骨细胞分成两部分,一部分进行细胞鉴定及培养传代,另一部进行雌激素干预实验。细胞鉴定与传代:用甲苯胺蓝染色法,结合形态学鉴定髁突软骨细胞,并进行原代细胞传代,观察细胞形态和增殖速度的变化。
　　雌激素干预实验:细胞分为空白对照组、17-β雌二醇组(10-3,10一6,10-9,lO-12mmol/L)。其中对照组仅加入同浓度的雌激素溶剂乙醇。用倒置显微镜观察细胞的形态变化,在细胞接近长满时给药,加药24小时后收集各组细胞进行RT-PCR,计算出每组细胞中GAPDH及ERα mRNA和ERβ mRNA的CT值,进行统计分析,所有数据以均数士标准差表示,采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法,量效关系用结果:刚接种的髁突软骨细胞呈球形,约12h后可见细胞贴壁,培养箱静置24h后可见大部分细胞贴壁,起初为圆形,后逐渐增大成多角形,有较多突起,胞核淡染。3-4天后,可见细胞呈集落状生长,一周左右细胞逐渐融合成单层,呈“铺路石“样生长。收集的原代细胞经甲苯胺蓝染色后见胞浆蓝染,细胞外可见异染颗粒。雌激素干预实验发现无论是实验组还是空白对照组中,ERα和ERβ在体外培养的髁突软骨细胞中均有表达,外源性的17β雌二醇能够上调ERα的基因表达同时下调ERβmRNA表达。其中10-9mmol/L作用下,ERαmRNA上调最为明显。
　　结论:1.体外培养的大鼠髁突软骨细胞传代至第三代后开始去分化。
　　2.大鼠髁突软骨细胞存在ERα和ERβ。
　　3.E2可以上调ERα的表达而下调ERβ的表达,在生理范围的雌激素浓度下,E2上调ERα基因表达的作用最为明显。

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1. 前言

2.材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物：

2.1.2试剂与耗材

2.1.3仪器

2.2方法

2.2.1原代细胞的分离与培养

2.2.2 下颌髁突软骨细胞的传代

2.2.3 下颌髁突软骨细胞的鉴定

2.2.4 雌激素干预实验

3.结果与统计学分析

3.1形态学观察

3.1.1倒置显微镜观察细胞形态

3.2 髁突软骨细胞鉴定

3.3不同浓度雌激素作用下ERα mRNA 和ERβmRNA的表达情况

3.3.1不同浓度实验组中GAPDH、ERα、ERβ mRNA的相对表达量

3.3.2不同浓度实验组中GAPDH、ERα、ERβ mRNA 的扩增曲线

3.3.3不同浓度实验组中GAPDH、ERα、ERβ mRNA的融解曲线峰图

4讨论

4.1髁突软骨细胞的体外培养

4.2软骨细胞的鉴定

4.3 雌激素受体在髁突软骨细胞中的表达

4.4雌激素与雌激素受体表达的量效关系

5.结论

参考文献

附录

致谢

综述