基于IgG4介导的蛋白质组学日本血吸虫诊断标志物的筛选及应用

摘要

目的：血吸虫病仍然是世界上危害最为严重的寄生虫疾病,由于我国政府的高度重视,我国血吸虫病疫情目前已达到基本控制阶段,传统的病原体直接检测技术已失去了金标准作用,低流行区血吸虫病的诊断遇到了严峻的挑战,提高监测敏感性为导向的低流行区监测技术是当前的重中之重,而血吸虫病的正确诊断是血吸虫病监控的第一步,也是最关键步骤。发展一种简便、经济、敏感和特异,尤其适合现场大规模检测的快速血吸虫病诊断方法,为我国血吸虫病的防控并最终消除提供重要的工具。
　　方法：制作日本血吸虫感染动物模型,收集日本血吸虫成虫;制备日本血吸虫成虫抗原(AWA),进行两维电泳(2-DE),再雇佣western-blot方法、用混合的血吸虫感染患者血清筛选,最后用抗人IgG4二抗检测血吸虫成虫抗原中能够与患者血清中IgG4抗体反应的抗原分子。切取这些与患者血清中IgG4结合的抗原分子用胰酶消化,进行质谱鉴定,并进行进一步的生物信息学分析,寻找具有诊断价值的候选分子,并克隆重组候选分子。最后将重组抗原包被反应板,用基于IgG4二抗作为检测工具的ELISA方法,来评估候选抗原在血吸虫病诊断中的应用价值。
　　结果：建立了日本血吸虫成虫两维电泳图谱,western-blot结果显示,基于IgG4为检测工具的血清蛋白组学筛选出40多个具有免疫反应性的阳性蛋白点,其中有16个点能够与原始的2-DE凝胶相对应。质谱鉴定结果表明,这16个点分属于10个蛋白质,它们分别是日本血吸虫顺乌头酸酶(SjAA)、热休克蛋白70(SjHSP70)、M2型丙酮酸激酶(SjPKM2)、磷酸甘油酸酯激酶(SjPGK1)、α-L-岩藻糖苷酶(SjALF)、无机焦磷酸酶(SjIPP)、谷胱甘肽转移酶(SjGST)、日本血吸虫21.7kDa抗原(Sj21.7)、22.6kDa膜相关抗原(Sj22.6)和曼氏血吸虫肌浆钙结合蛋白(SmSCP)。通过生物信息学分析,SjIPP具有多种潜在的生物学功能,更重要的是,SjIPP含有丰富的B细胞抗原表位,可能预示,SjIPP在血吸虫病的疫苗开发和诊断应用中具有良好的前景。进一步,我们成功克隆并原核表达出了重组SjIPP(rSjIPP),而且纯化的rSjIPP纯度好,浓度也达到了3.5mg/ml。ELISA结果显示,rSjIPP对急性血吸虫感染诊断的敏感性极高,达到了100％,对慢性血吸虫感染诊断也较高,其敏感性为87.1%,其特异性为95%;可喜的是,与其它寄生虫的交叉反应较低,分别是肺吸虫为3.7%、肝吸虫为4.5%、线虫为4.2%。
　　结论：利用IgG4为检测工具的血清蛋白质组学,成功从日本血吸虫成虫中筛选出了SjIPP诊断候选分子,并成功重组出rSjIPP。ELISA结果证明,rSjIPP在血吸虫病的诊断中具有良好的应用前景。

目录

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中文摘要

英文摘要

前言

1. 材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果

2.1 AWA抗原浓度

2.2 AWA的血清蛋白质组学分析

2.3免疫反应性抗原的质谱鉴定

2.4 SjIPP生物信息学分析

2.5 SjIPP克隆、表达及鉴定

2.6 rSjIPP的诱导表达

2.7 rSjIPP的免疫学鉴定

2.8 rSjIPP纯化

2.9 rSjIPP在血吸虫病诊断中的评估

3 讨论

4 结论

4.1 利用基于 IgG4导向的血清蛋白组学方法成功从日本血吸虫成虫抗原中筛选出了rSjIPP候选分子；

4.2本研究第一次成功克隆、重组并原核表达了rSjIPP；

4.3 rSjIPP是潜在的日本血吸虫病诊断抗原。

参考文献

个 人 简 历

致谢

综述