多重荧光定量PCR核酸检测方案构建及应用

目录

声明

第一章 绪 论

1.1端粒概述

1.1.1 端粒长度检测的应用

1.1.2 端粒检测技术介绍

1.2支原体检测研究进展

1.2.1支原体介绍

1.2.2支原体检测技术

1.3基因修饰技术

1.3.1转座子重组工程

1.3.2基因组修饰技术-“in-out方法”

1.3.3 “线性片段”方法（重组）

1.3.4体内克隆和靶向长片段基因修饰技术

1.3.5 Scarless Cas9 Assisted Recombineering(no-SCAR)

1.4 研究内容

第二章多重荧光定量PCR端粒长度检测方案建立

2.1 材料和仪器

2.1.1细胞抽提基因组DNA

2.1.2细胞基因组DNA纯化的试剂

2.1.3荧光定量PCR所用试剂

2.1.4常用试剂配制

2.1.5主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1乙醇法纯化DNA

2.2.2多重荧光定量PCR端粒长度检测引物及探针设计

2.2.3分子信标检测端粒长度方案建立

2.2.4 Uniprimer检测端粒长度方案建立

2.2.5多重荧光定量PCR方法检测端粒长度方案建立1、反应体系摸索

2.3 实验结果

2.3.1 单重分子信标检测端粒长度

2.3.2 Uniprimer检测端粒长度方案建立

2.3.3 多重荧光定量PCR方法检测端粒长度方案

2.4实验结论

第三章 端粒长度检测标准品制备

3.1. 材料和仪器

3.1.1细胞及血液样本

3.1.2材料及试剂

3.2实验方法

3.2.1血液基因组抽提

3.2.2引物和探针设计

3.2.3 pGRG36载体及TEL-pUC57载体验证

3.2.4 36B4 PCR产物获得

3.2.5 TEL PCR产物获得

3.2.6 36B4标准品制备

3.2.7 TEL标准大肠杆菌基因组制备

3.3实验结果

3.3.1 pGRG36载体验证结果

3.3.2 TEL-pUC57载体验证

3.3.3 36B4 PCR产物验证结果

3.3.4 TEL PCR产物验证

3.3.5 36B4标准品构建结果

3.3.6 TEL标准品构建结果

3.3.7多重荧光定量PCR方法检测端粒长度的应用

3.4实验结论

第四章 多重荧光定量PCR支原体检测及应用

4.1. 材料和仪器

4.1.1细胞

4.1.2材料及试剂

4.2实验方法

4.2.1样本处理

4.2.2引物和探针设计

4.2.3细胞阳性支原体污染PCR产物的获得

4.2.4参考基因TOP3A PCR产物的获得

4.2.5支原体阳性对照标准品的制备

4.2.6参考基因TOP3A标准品的制备

4.2.7支原体检测多重荧光定量PCR反应

4.2.8灵敏度和特异性试验

4.2.9应用

4.3 结果

4.3.1支原体定量PCR扩增产物NCBI BLAST比对

4.3.2支原体阳性对照标准品的制备

4.3.3参考基因TOP3A标准品的制备

4.3.4多重荧光定量PCR检测支原体扩增曲线

4.3.5多重荧光定量PCR检测支原体的灵敏度检测

4.3.6多重荧光定量PCR检测支原体的标准曲线的建立

4.3.7多重荧光定量PCR检测支原体的重复性检测

4.3.8多重荧光定量PCR检测支原体方法的应用

4.4. 实验结论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2展望

参考文献

课题来源

攻读硕士学位期间发表学术论文

致谢