外周Th17/Treg失衡在肺腺癌及肺鳞状上皮细胞癌中的作用及相关机制探讨

摘要

肺癌无论是发病率还是死亡率,均居全球癌症首位。按组织病理学分类,分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,据估计,非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌类型的80％,其中肺腺癌和肺鳞状上皮细胞癌占据了NSCLC的绝大多数。近二十年来,虽然以含铂类化疗为主的综合治疗使肺癌的生存率有所延长,但是五年生存率仍然低于15%,并且由于化疗的附加损害,肺癌患者的生活质量和实际生存期并未显著改善,因此,探索新的治疗手段,寻找更为有效的治疗模式成为研究热点。肺癌的抗肿瘤免疫失衡研究可能为治疗提供一种极具前景的治疗模式。
　　CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)是两类不同于Th1和Th2的CD4+T淋巴细胞。Treg细胞是CD4+T细胞的一类特殊分支,在维持免疫稳态和免疫耐受上发挥重要作用,可以避免免疫炎症反应的扩大和减轻免疫机体损伤,在机体免疫系统中发挥负向调节作用。在动物和人研究中发现,调节性T细胞的缺失可以导致严重的自身免疫性炎症;相反,Treg细胞的增多也不利于机体,在许多癌症中,增加的Treg细胞通过与自身免疫监控系统的相互作用,抑制抗肿瘤免疫活性细胞,促进了癌症的进展。Foxp3是Treg细胞特异的标记物,Foxp3属转录因子Forkhead家族,它可以控制Treg细胞的发生发育,剔除FoxpTreg细胞和Th17细胞之间存在复杂的相互关系,二者在分化上相互联系,在功能上相互拮抗,二者的平衡在肿瘤的发生发展中具有重要作用。目前,Th17/Treg的平衡紊乱已经成为恶性肿瘤研究领域中新的热点,但是,在非小细胞肺癌中的研究尚少,是否存在比较显著的Th17/Treg紊乱尚不清楚,与不同分期NSCLC的关系有待进一步探讨。
　　目的：
　　通过分析Th17/Treg失衡与不同分期NSCLC的关系,分析相关转录因子及细胞因子的水平变化,探讨 Th17/Treg失衡在 NSCLC发病中的分子机制,明确Th17/Treg失衡在NSCLC中的意义。
　　方法：
　　1.收集59例非小细胞肺癌患者及健康对照外周血标本
　　临床病理确诊患者30例鳞癌、29例腺癌和10名健康对照的外周血标本,标本分为两份,一份用于细胞分型、mRNA、蛋白质检测;另一份冻存以备细胞因子检测。
　　2.多参数流式细胞术检测肺腺癌和肺鳞癌外周血单个核细胞中Treg细胞和Th17细胞表达率
　　分别检测59例NSCLC患者外周血单个核细胞中Treg细胞和Th17细胞在T细胞中的表达率。
　　3. Real time quantitative PCR检测非小细胞肺癌外周血单个核细胞中RORγt及FoxP3mRNA水平
　　分别提取非小细胞肺癌外周血有核细胞总RNA,用RT-PCR法检测Th17细胞转录因子RORγt和Treg细胞FoxP3 mRNA表达水平。
　　4. Western-blotting检测非小细胞肺癌外周血单个核细胞中RORγt和Foxp3蛋白表达水平
　　分别提取分别提取非小细胞肺癌外周血单个核细胞总蛋白,采用western-blotting方法分别检测RORγt和Foxp3蛋白表达情况。
　　5.酶联免疫吸附法检测非小细胞肺癌外周血清中细胞因子的水平
　　用ELISA试剂盒分别检测非小细胞肺癌外周血清细胞因子IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β1的水平。
　　结果：
　　1.59例非小细胞肺癌患者的临床资料
　　59例非小细胞肺癌患者,其中鳞癌30例,男性18例,女性12例,年龄56-81岁,平均年龄64.7岁;腺癌29例,男性18例,女性11例,年龄55-80岁,平均年龄63.0岁,所有患者均符合WHO诊断与分期标准,Ⅰ期7人,Ⅱ期13人,Ⅲ期19人,Ⅳ20人。同期选择10名健康志愿者作为对照。
　　2.非小细胞肺癌外周血中Treg细胞表达率升高
　　流式细胞学分析结果表明:与对照组相比,鳞癌组外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞表达率显著升高(5.598±0.227%vs.3.444±0.2974%, P<0.05);腺癌组也显著升高(7.237±0.377%vs.3.444±0.2974%,P<0.05)。
　　3.非小细胞肺癌外周血中Th17细胞表达率下降
　　流式细胞学分析结果表明:与对照组相比,鳞癌患者外周血中Th17细胞表达率(0.4313±0.0209% vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)明显下降,腺癌组(0.3624±0.0273%vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)也显著下降。
　　4.非小细胞肺癌外周血中Th17/Treg比率下降,且与分期呈负相关
　　比较分析 Th17/ Treg比率表明:与健康对照组相比,腺癌(0.1865±0.0212 vs.0.1865±0.0212,P<0.05)及鳞癌(0.0547±0.0054 vs.0.1865±0.0212, P<0.05) Th17/Treg比率明显下降,且分期越差,比例下降越明显,Th17/Treg比例与NSCLC分期呈负相关。
　　5.非小细胞肺癌外周FoxP3mRNA表达显著升高,但RORγtmRNA表达降低
　　RT-PCR结果表明:与健康对照组相比,鳞癌 Treg细胞相关转录因子FoxP3mRNA表达显著升高(0.9957±0.1799 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),腺癌FoxP3mRNA表达显著升高(1.681±0.2401 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),鳞癌Th17细胞相关转录因子RORγt表达降低(2.101±0.2759 vs.4.202±0.9663,P<0.05),腺癌RORγt表达降低(1.126±0.1725 vs.4.202±0.9663,P<0.05),鳞癌组与腺癌组相比 FoxP3mRNA(0.9957±0.1799 vs.1.681±0.2401, P>0.05), RORγtmRNA(2.101±0.2759 vs.1.126±0.1725 P>0.05)无明显差异。
　　6.非小细胞肺癌Foxp3蛋白表达显著升高,但RORγt蛋白表达下降
　　Western-blotting结果表明:肺鳞癌和腺癌患者的 Foxp3蛋白表达分别是健康对照组的3.245( P<0.05),5.119( P<0.05),腺癌组Foxp3表达水平高于鳞癌组(5.119 vs.3.245,P<0.05);鳞癌及腺癌组RORγt蛋白表达水平分别是健康对照组的0.6693( P<0.05),0.5456( P<0.05),两者RORγt蛋白表达水平无差异(0.6693 vs.0.5456,P>0.05)。
　　7.非小细胞肺癌外周血清中IL-10、TGF-β1显著升高,IL-6、IL-17显著降低
　　ELISA法结果表明:与健康对照比较,鳞癌外周血清Treg细胞相关因子IL-10(898±52.45 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL,P<0.05)、TGF-β1(408.9±25.5 ng/mL vs.189.4±27.51 ng/mL,P<0.05)显著升高;鳞癌组 Th17细胞相关因子 IL-6(327.8±44.44 ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL,P<0.05)、IL-17(588.3±71.67 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)显著下降;与健康对照比较,腺癌IL-10(1458±145.8 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL, P<0.05)、TGF-β1(541.5±32.9 ng/mL vs.189.4±27.51 ng/mL,P<0.05)升高,IL-6(369.5±61.5ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL, P<0.05)、IL-17(613.6±92.06 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)显著下降。
　　结论：
　　1.非小细胞肺癌常见病理类型腺癌和鳞癌外周Th17/Treg平衡紊乱,Treg细胞表达显著增强,Th17细胞表达率下降,相关转录因子RORγt和Foxp3,相应主要细胞因子IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β1等均发生对应变化,提示Th17/Treg平衡紊乱在NSCLC的发生、发展中产生重要影响。
　　2.肺腺癌较鳞癌的免疫抑制明显,可能与腺癌较易发生血行转移有关。
　　3.非小细胞肺癌常见病理类型腺癌和鳞癌Th17/Treg平衡与分期呈负相关。

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英文缩略词对照表（Abbreviation）

中文摘要

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前言

第一部分非小细胞肺癌外周Th17细胞、Treg细胞水平的变化及与分期的关系

中文摘要

1. 材料与方法

1.1 研究对象

1.2 仪器和试剂

1.3 检测方法

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 患者基本资料比较

2.2 流式细胞术分选出的Treg细胞和Th17细胞

2.3 各组外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞表达水平

2.4 各组外周血CD3+CD8-IL-17+T淋巴细胞表达水平

2.5 各组外周血Th17/Tregs比例变化及与分期的关系

3 讨论

参考文献

第二部分非小细胞肺癌外周Th17细胞、Treg细胞相关转录因子RORγt和Foxp3及相关细胞因子（IL-6, IL-17, IL-10和TGF-β1）的表达

中文摘要

1.材料与方法

1.1 研究对象

1.2 细胞和试剂

1.3 RT-PCR

1.4 Western blotting

1.5 ELISA

1.6统计学处理

2结果

2.1 PCR结果

2.2转录因子Foxp3 和RORγt的mRNA表达水平

2.3转录因子Foxp3 和RORγt的蛋白表达

2.4 Th17、Treg细胞相关细胞因子的表达水平

3 讨论

参考文献

全文结论

本课题的创新点和不足之处及对课题的进一步设想

附录1

致谢

综述