瑞替普酶融合蛋白的表达、纯化及分子伴侣对其复性的影响

摘要

目的：构建瑞替普酶r-PA融合蛋白的原核表达体系,并研究DsbA、DsbC、pKJE7、pGro7、pTf16等分子伴侣对其复性的影响。方法:将r-PA基因克隆到表达载体质粒PET-32a中,经PCR及EcoRI、BamHI双酶切鉴定后将重组表达载体PET-32a-r-PA转化至感受态大肠杆菌BL21,通过筛选得到阳性克隆后经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定。目的蛋白包涵体变性后经镍离子金属螯合层析纯化。37℃培养含有表达分子伴侣蛋白基因重组质粒的工程菌,IPTG诱导表达。在r-PA融合蛋白复性时分别添加不同分子伴侣,研究不同分子伴侣对融合蛋白体外复性的影响。
　　最后采用纤维蛋白-琼脂糖平板测定法测算纯化、复性后样品的单位活性。结果:经PCR及EcoRI、BamHI双酶切鉴定结果表明重组表达载体PET-32a-r-PA构建成功;SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果表明r-PA融合蛋白得到正确表达;添加分子伴侣参与复性后结果显示添加DsbA、pKJE7、pTf16蛋白组的辅助复性效果明显,复性率达20％左右;纤溶活性检测表明纯化、复性后样品具有纤溶活性,通过计算得到样品的比活为4.8x105IU/mg。
　　结论:分子伴侣能有效帮助r-PA融合蛋白的复性。

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1 前 言

2 材料与方法

2. 1常用仪器与设备

2. 2 质粒与菌株

2. 3 试验试剂

2. 4 引物设计

2. 5 常用溶液及培养基的配制

2. 6 方法

3 结果

3.1 表达载体PET-32a-r-PA的构建与鉴定

3.2 表达产物的SDS-PAGE及Western blot鉴定

3．3 产物的纯化

3．4 分子伴侣蛋白的表达

3．5 分子伴侣蛋白对r-PA融合蛋白复性的影响

3．6 纤溶活性检测

4 讨 论

4.1 表达体系和宿主菌的选择

4.2 表达载体

4.3 包涵体蛋白复性

4.4 分子伴侣辅助目的蛋白复性[J]．

4.5 金属螯合层析

4.6 活性检测

参考文献

附 录

致谢

综述