微波辐射致大鼠海马组织差异表达的microRNA与学习记忆关系的研究

摘要

目的意义：微波技术广泛应用于通讯、广播和医疗等领域,给人们生活带来便利的同时也对人们的健康造成了潜在危害。研究表明,微波具有明显的中枢神经系统损伤效应,海马是微波辐射的敏感脑区,学习记忆能力障碍是微波辐射致海马损伤的重要表现形式,但其作用机制尚未明确。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性小分子非编码RNA,参与细胞分裂增殖、凋亡、发育、分化和代谢等几乎所有重要的生命活动。已有研究表明,脑特异表达miRNA作为效应子参与成熟神经元生物学进程,包括神经系统的发育分化、突触可塑性等。但是,微波辐射后海马组织内差异表达的miRNA及其与学习记忆功能的关系研究尚未见报道。因此,研究微波辐射后大鼠海马组织的miRNA表达谱改变及其在学习记忆能力变化中的作用,对阐明微波辐射脑损伤机制及寻找敏感靶标具有重要意义。
　　材料方法：(1)采用平均功率密度为30mW/cm2微波辐射58只二级雄性Wistar大鼠,辐射时间为10min/次,隔天辐射1次,共辐射3次。于微波辐射后6h、1d、7d、14d和28d,采用Morris水迷宫观察学习与记忆功能变化;采用高效液相色谱法分析海马组织中4种氨基酸类神经递质含量的变化;通过光镜和电镜观察海马组织学与超微结构改变;(2)采用Exqion公司的miRCURYTMLNAmiRNA芯片,检测大鼠海马组织的miRNA表达谱,以变化差异在1.5倍以上且具有统计学意义(P<0.05)作为标准筛选差异表达的miRNAs。(3)利用生物信息学数据库(miRbase、miRanda和miRDB)对差异表达miRNA的靶基因进行预测,采用GO注释系统(geneontologycategory,GO)对靶基因进行功能分类,并通过京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)对靶基因参与的信号通路进行预测。(4)采用Real-timePCR验证部分差异表达的miRNAs,并深入分析相关差异miRNA的靶基因和信号通路与学习记忆的关系。
　　实验结果：(1)微波辐射对大鼠海马的损伤效应:30mW/cm2微波辐射后6h和7d,大鼠平均逃避潜伏期显著延长(P<0.05)。辐射后1d,海马组织Asp、Glu与GABA含量明显降低(P<0.01);辐射后7d,Asp和Gly含量明显升高(P<0.05)。微波辐射后1d,海马组织水肿,少量神经元固缩深染、血管周围间隙增宽,7d损伤加重,14d见恢复,28d基本恢复。辐射后7d,海马神经元线粒体肿胀、空化,突触减少,突触间隙模糊,突触后致密物减少。(2)微波辐射后大鼠海马差异表达的miRNA改变:30mW/cm2微波辐射后7d,85个miRNAs出现差异改变(Fc>1.5,P<0.05),其中12个miRNA显著上调,73个miRNA显著下调;辐射后14d,18个miRNAs出现差异改变(Fc>1.5,P<0.05),其中2个miRNA显著上调,16个miRNA显著下调。(3)差异表达的miRNA靶基因预测及功能分析:辐射后7d,miRbase、miRanda和miRDB数据库分别预测到44639个、29918个和7324个靶基因,三个数据库预测到的共同靶基因有931个;辐射后14d,miRbase、miRanda和miRDB数据库分别预测到6780个、6705个和2273个靶基因,三个数据库预测到的共同靶基因有155个。所预测的靶基因功能各异,主要涉及学习记忆、能量代谢、增殖与死亡、应激、细胞周期、信号传导、血脑屏障、离子通道等。靶基因参与的信号通路主要包括神经营养因子信号通路、昼夜节律和安非他明成瘾、三羧酸循环、突触囊泡循环、长时程抑制、色氨酸代谢、Ca2+信号通路、5-羟色胺能突触传递和多巴胺能突触传递等。(4)差异表达miRNA的Real-timePCR验证结果:对差异表达的miRNAs中rno-miR-125b-5p、rno-miR-338、rno-miR-125a-5p、rno-miR-181a、rno-miR-9以及rno-let-7b检测结果均与芯片结果一致。(5)已验证的miRNA与学习记忆功能关系分析:rno-miR-125b-5p、rno-miR-338、rno-miR-125a-5p、rno-miR-181a、rno-miR-9以及rno-let-7b可通过靶基因作用于离子通道、神经递质分泌传递、线粒体活性、细胞凋亡和信号转导等,最终影响学习记忆能力。
　　结论：(1)30mW/cm2的微波辐射可导致大鼠学习记忆能力障碍,海马神经递质代谢紊乱,海马组织和超微结构损伤。表明成功建立了微波辐射致大鼠海马损伤的动物模型。(2)30mW/cm2微波辐射后,大鼠海马组织百余个miRNAs的表达出现明显变化,且其参与了微波辐射海马损伤过程,是微波辐射致海马损伤的重要机制之一。(3)微波辐射后大鼠海马差异表达的miRNA预测靶基因的功能各异,主要涉及学习记忆、线粒体能量代谢、增殖与死亡、应激、细胞周期、信号传导、血脑屏障、离子通道等,表明微波辐射致大鼠海马损伤是miRNA通过对靶基因的协同调控作用结果,该调控具有多靶点、多通路、网络化的特点。(4)rno-miR-125b-5p、rno-miR-338、rno-miR-125a-5p、rno-miR-181a、rno-miR-9以及rno-let-7b的Real-timePCR验证结果与芯片结果一致,它们的靶基因功能及其参与的信号通路与学习记忆密切相关,可能通过作用于离子通道、神经递质分泌传递、线粒体活性、细胞凋亡和信号转导等,最终影响学习记忆能力,表明上述miRNA是参与调控微波辐射学习记忆障碍的重要效应子。

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前言

参考文献

第一部分 微波辐射对大鼠海马的损伤效应

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 微波辐射后大鼠海马差异表达miRNA的筛选、靶基因预测及功能分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分 微波辐射后大鼠海马差异表达miRNA的验证及与学习记忆关系分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

附录

致谢

文献综述