白色念珠菌菌丝壁蛋白1的N端片段的克隆及原核表达

摘要

目的：
　　随着糖皮质激素、免疫抑制剂和广谱抗菌药物、介入性治疗等诊疗技术的广泛应用,以及艾滋病患者的增加,真菌感染的发病率日趋升高。调查显示侵袭性白色念珠菌病占所有深部真菌感染的比例一直高达70％-85%。尽管有抗真菌药物的治疗,但由于早期诊断困难,侵袭性白色念珠菌病往往预后极差。白色念珠菌是一种既能以酵母形态又能以菌丝形态生长的真菌,产生菌丝是其具有致病力的一种表现,Staab等首先发现白色念珠菌菌丝壁蛋白1(hyphal wall protein 1,Hwp1),研究显示,Hwp1具有菌丝特异性及抗原性和种属特异性特点,使其在侵袭性念珠菌病诊断中可能发挥重要作用。本研究拟构建白色念珠菌的菌丝壁蛋白1(Hwp1)N端片段的重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白。为后续探讨Hwp1抗原、抗体系统在诊断侵袭性白念珠菌的作用和地位奠定基础。
　　方法：
　　1.目的基因的制备:使用酵母基因组提取试剂盒白色念珠菌基因组DNA,经PCR方法扩增获得目的基因。
　　2.目的基因的克隆:将目的基因克隆至pMD18-T载体上,通过蓝白筛选法获得克隆成功的质粒,经PCR法及双酶切法鉴定目的基因后测序进行检验。
　　3.重组Hwp1的N端片段的诱导表达:将目的基因连接至表达载体pET28a(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,提取质粒进行PCR、双酶切法鉴定,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导、超声裂解菌体、SDS-PAGE电泳观察结果,获得重组表达的目的蛋白。
　　结果：
　　1.经PCR方法克隆出全长为500bp的Hwp1基因的N端的核苷酸序列与GenBank中公布的序列基本同源。
　　2.成功制备了重组质粒pMD18-T-Hwp1及pET28a(+)-Hwp1,PCR及双酶切法鉴定结果。
　　3.构建了含重组质粒pET28a(+)-Hwp1的大肠杆菌工程菌,经IPTG诱导能高效表达目的蛋白。
　　结论：
　　1.成功构建了白色念珠菌基因Hwp1基因N端序列的原核表达质粒pET28a(+)-Hwp1。
　　2.Hwp1基因N端序列的原核表达质粒在大肠杆菌BL-21中成功表达融合蛋白,为进一步研究其在诊断白色念珠菌病中的作用奠定了基础。

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缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 已提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增

2.4对扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测

2.5 PCR产物回收及琼脂糖凝胶电泳检测

2.6 克隆载体构建及鉴定

2.7 表达载体构建

2.8 在大肠杆菌诱导表达

2.9 SDS-PAGE

3结果

4讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述