神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖及细胞单层通透性的影响

摘要

目的：建立胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代培养方法,研究神经酰胺对其体外增殖的影响,并观察神经酰胺在 AECⅡ单层通透性变化中的作用,为进一步研究神经酰胺在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征发病机制中的作用及地位奠定实验基础。
　　方法：1.取1只妊娠17.5d的SPF级ICR小鼠,将其体内的胎鼠AECⅡ用胰蛋白酶消化法分离后,通过差速贴壁法纯化。将获得的AECⅡ在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况,并应用碱性磷酸酶染色法及电镜进行鉴定;2.将 AECⅡ制成细胞悬液,调整细胞浓度为1×105个/ml,分别加入终浓度为0(溶剂对照,DMEM)、25、50、60、70、80、90、100μmol/L的神经酰胺溶液,培养12、24和48h后进行MTT试验;3.在Transwell上构建AECⅡ单层;倒置显微镜及跨上皮电阻测量仪观察细胞单层生物学特征;4.应用跨上皮电阻测量仪及辣根过氧化物酶标记法检测神经酰胺对AECⅡ单层通透性的影响。
　　结果：1.用此方法所得的AECⅡ产量为1×106-4×106个/只孕鼠,纯度为80％以上,细胞活力90%以上。2.随着神经酰胺染毒浓度的升高和染毒时间的延长,AECⅡ细胞增殖抑制率呈上升趋势。3.3×105/cm2和的AECⅡ接种Transwell后,TER随接种时间延长迅速升高,接种后第48h达最高,尔后TER开始逐渐下降,而倒置显微镜观察到细胞接种后第36h已融合成单层;5×105/cm2的AECⅡ接种Transwell后,TER达高峰时间提前到接种后第36h,尔后TER开始逐渐下降;不同密度接种组的TER最高值间比较无显著性差异(p>0.05)。4.25μmol/L的神经酰胺分别刺激融合AECⅡ单层6h和12h后,与未处理对照组比较,TER显著下降、OD470均显著增加。
　　结论：1.通过胰蛋白酶消化法分离及差速贴壁法纯化获得的胎鼠AECⅡ生长状态良好,产量及纯度高,可用于体外实验研究。2.神经酰胺可降低 AECⅡ的细胞活力,抑制其体外增殖。3.TER联合倒置相差显微镜较单独应用倒置相差显微镜对AECⅡ单层融合状态的判断具有更高的准确性。4.TER及辣根过氧化物酶标记法均能有效检测细胞单层通透性的变化,两者联用可获得更多反映通透性变化的信息。

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1. 前言

2. 材料与方法

2.1 AECⅡ的分离、培养和鉴定

2.2 MTT法测定神经酰胺对AECⅡ增殖的影响

2.3 AECⅡ单层通透性检测

2.4 统计学方法

3. 结果

3.1 AECⅡ的产量、纯度、活力

3.2 AECⅡ的鉴定

3.3 神经酰胺对AECⅡ体外增殖的影响

3.4 Transwell上AECⅡ单层融合特征

3.5 神经酰胺对AECⅡ细胞单层通透性的影响

4.讨论

4.1 AECⅡ的原代培养和鉴定

4.2 神经酰胺对AECⅡ体外增殖的影响

4.3 Transwell上AECⅡ单层融合特征

4.4 神经酰胺对AECⅡ细胞单层通透性的影响

5. 结论

6. 参考文献

附录

致谢

参考文献