弓形虫毒力因子ROP18激酶的致病分子机制研究

摘要

背景:
　　弓形虫是一种专性细胞内寄生虫,可以感染几乎所有的温血动物,会引起世界范围内传播的人兽共患病。免疫功能正常人群感染弓形虫不会出现明显症状,但免疫功能低下或缺陷者感染弓形虫则会引发严重的并发症,目前弓形虫感染已经成为AIDS和器官移植患者重要死亡因素之一。基因组数量特征分析、转基因弓形虫实验及菌株杂交实验均证明 ROP18能提高弓形虫的增殖速率,对感染动物有致死作用,因此,ROP18是弓形虫重要的毒力因子,本研究采用酵母双杂交方法筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白,通过免疫沉淀、GST-pull down、酵母共转以及免疫荧光进一步证实 ROP18与宿主 NF-κB p65的相互作用,提示 ROP18可能通过宿主NF-κB发挥其致病作用,为弓形虫病致病机制研究提供依据。
　　目的:
　　采用酵母双杂交法筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的蛋白及ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定,为弓形虫致病机制研究提供依据。
　　方法:
　　本实验分为两部分:(1)RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7中,将重组质粒导入酵母AH109菌株中,检测诱饵载体是否有毒性和自激活作用,利用酵母双杂交从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的蛋白;(2)RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段,扩增产物经双酶切后插入 PCR blunt II Topo vector构建pROP18,从pROP18扩增出ROP18编码序列,将纯化的PCR产物克隆至pTUB8-mycGFPPftailTY,构建pTUB8-ROP18-TY质粒,将质粒电穿孔转染弓形虫RH株,弓形虫悬浮液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM筛选高表达ROP18的弓形虫RH株,收集虫体,腹腔注射昆明小鼠,免疫荧光检测ROP18在转基因弓形虫株中的表达,吉姆萨染色比较RH株与高表达ROP18的RH株的细胞增殖速率,酵母共转、GST-pull down及免疫共沉淀证明ROP18与p65之间存在相互作用,免疫荧光双标实验观察ROP18与宿主p65共定位。
　　结果:
　　1.ROP18相互作用的宿主蛋白的筛选
　　1)酶切鉴定表明质粒构建成功。
　　2)用玻璃珠(美国Sigma公司)法提取转了质粒pGBKT7-ROP1825–251 aa的酵母蛋白,WB检测显示ROP18蛋白表达,阴性组不表达。
　　3)发现ROP18全长具有自激活功能,因此用ROP1825-251aa为诱饵,筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白:NF-κB p65蛋白、DNA损伤特异性结合蛋白1(DDB1)、转录激活因子ATF6β、torsinA相互作用蛋白1(TOR1AIP1)、溶质运载蛋白3(SLC3A2)、Derl样域家族成员2(DERL2)、酪氨酸硫化转移酶2(TPST2)、OCIA结构域蛋白1(OCIAD1)和整联蛋白β1(integrinβ1)。
　　2.ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定
　　1)将转基因弓形虫感染后的细胞固定和抽提以后,染Ty1鼠mAb(绿色)、DAPI(蓝色),重叠图像表明在弓形虫顶端的棒状体附近有ROP18蛋白表达。
　　2)吉姆萨染色证明R O P18过表达弓形虫株较 R H株弓形虫增殖快,ROP18能够促进弓形虫在细胞内的增殖。
　　3)酵母共转:将p65构建到pGADT7载体,然后与ROP18的酵母表达载体共转至酵母AH109菌株,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上验证,结果表明p65是通过二聚化结构域与ROP18相互作用。
　　4)细胞免疫荧光:将ROP18过表达的弓形虫感染后的HFF细胞固定和抽提以后,共染Ty1鼠mAb(绿色)、p65兔mAb(红色)、DAPI(蓝色),重叠图像表明弓形虫ROP18和宿主NF-κB p65共定位于宿主细胞质。
　　5)免疫共沉淀:将ROP18-Δ27-GFP与GFP分别转染293t细胞,用GFP抗体沉淀细胞裂解液中的p65,免疫沉降物经SDS-PAGE,转移到NC膜上,分别用GFP和p65抗体杂交,发现p65存在于ROP18-Δ27-GFP的免疫复合物中,因此p65和ROP18可以在细胞内发生相互作用。
　　6)GST-pull down:将纯化后的带GST标签的ROP18蛋白与带HIS标签的p65-M蛋白进行GST-pull down实验,发现p65-M能与ROP18直接相互作用,进一步验证p65是通过二聚化结构域与ROP18相互作用。
　　结论:
　　(1)通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。
　　(2)高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫可遗传系统构建成功。
　　(3)ROP18与NF-κB p65相互作用。

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中文摘要

英文摘要

1.前言

2.实验材料

2.1虫株与细胞

2.2质粒

2.3主要试剂

2.4 部分试剂溶液的配制

3.实验方法

3.1酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子 ROP18相互作用的宿主蛋白

3.2 ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定

4.结果

4.1酵母双杂交筛选与弓形虫毒力因子 ROP18相互作用的宿主蛋白

4.2 ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定

4.5 免疫荧光双标

5.讨论

6 结论

7 本研究的创新点

参考文献

附录

致谢

综述