远志提取物清除β淀粉样蛋白的途径及其信号通路的研究

摘要

背景:目前在对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病机制研究中,β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)假说占据了重要地位。Aβ作为AD发病的起始因子,可导致淀粉样斑块(senile plaques,SP)的形成、Tau蛋白高度磷酸化、神经纤维的缠结(neuron fiber tangles,NFT)、神经元炎症、神经元功能丧失及死亡、痴呆等一系列病理变化。许多研发中的抗AD药物都是将Aβ作为靶点,以减少其生成或促进清除来延缓病程的发展。细胞自噬作为机体清除自身异常物质的主要途径,引起了研究者的广泛关注,增加自噬作用可以促进细胞清除过多的Aβ,这或许成为治疗AD的一个重要策略。
　　目的:本研究从体外水平考察远志提取物(Polygala Tenuifolia Extract,PTE)对稳转APP/BACE1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株分泌Aβ的影响,并进一步探讨细胞自噬在引起这一变化中的作用及信号通路改变。
　　方法:将复苏的细胞培养于100 mm培养皿内,次日换液,待生长密度达80％-90%时传代。从第三代开始,在细胞在生长对数期时种板,贴壁后用不同浓度(0、5、10、20、40、100μg/ml)的PTE处理24 h,0μg/ml作为对照组,并进行以下检测研究:
　　(1)MTT法检测PTE对神经细胞株活力的影响。另外,在外源性Aβ的毒性作用下,考察PTE对神经细胞的保护作用;
　　(2)ELISA检测CHO-APP/BACE1细胞分泌Aβ水平的变化;
　　(3)荧光显微镜观察MDC染色后神经细胞内自噬小泡的变化;
　　(4)Western blot考察自噬标志蛋白LC3的表达情况;
　　(5)Western blot检测与自噬通路密切相关的激酶mTOR、p70s6k、Akt、AMPK、Raptor及其磷酸化蛋白的表达情况。
　　结果:(1)MTT结果显示各浓度PTE处理组与对照组间细胞活力差异无统计学差异(P>0.05);
　　(2)Aβ处理组细胞活力比未处理组明显下降,表明Aβ对神经细胞有显著的毒性,当有PTE存在的情况下,且浓度达到100μg/ml时,神经细胞活力有一定程度的恢复;
　　(3)在10μg/ml PTE处理组时,CHO-APP/BACE1细胞分泌Aβ水平已经有显著下降(P<0.01),并呈浓度依赖性;
　　(4)荧光显微镜下观察发现,相比对照组,PTE处理后的神经细胞的细胞质内有更多的绿色圆点结构,即被染色的自噬小泡;
　　(5)Western blot结果表明,随着给药浓度增加,LC3蛋白逐渐由I型向II型转变,自噬标志物LC3II/LC3I逐渐增加;
　　(6)Western blot结果显示,自噬的抑制性激酶mTOR磷酸化水平随着PTE浓度升高逐渐下降,其下游的p70s6k磷酸化水平也随之降低。位于mTOR上游,能够抑制mTOR活化的激酶AMPK和Raptor磷酸化水平升高,而另外一个通路中能够促进mTOR活化的Akt则没有明显变化。
　　结论:当PTE在100μg/ml以下时,对神经细胞活力没有影响,且有一定的细胞保护的作用;Western blot结果表明PTE可能是通过激活细胞AMPK/Raptor通路,抑制了mTOR和p70s6k的活化,诱导自噬作用增强,增强的自噬途径促进细胞清除过多的Aβ,减少Aβ的分泌。

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1引言

2 材料与方法

2.1 药品和试剂

2.2 主要仪器

2.3常用试剂配制

2.4细胞复苏、培养与冻存

2.5 PTE的提取

2.6 PTE对细胞活力的影响

2.7 PTE的神经保护作用

2.8 CHO-APP/BACE1细胞分泌Aβ蛋白水平的检测

2.9 MDC染色

2.10 LC3II/LC3I的变化：

2.11 WB检测mTOR，AMPK，Akt，Raptor，p70s6k磷酸化水平的变化

2.12 统计学分析

3 结果

3.1 PTE对细胞活力的影响

3.2 PTE对神经细胞的保护作用

3.3 PTE对CHO-APP/BACE1细胞分泌Aβ的影响

3.4 自噬的检测

3.5 PTE对神经细胞自噬相关蛋白表达水平的影响

4 讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述