高效液相色谱-在线纳米金催化的鲁米诺化学发光联用技术检测儿茶酚胺类神经递质和多巴类药物的研究

摘要

儿茶酚胺类神经递质在人体的肾上腺髓质和交感神经终端生成,是中枢神经系统中一类重要的神经递质,它们被广泛地用于治疗和诊断如嗜铬细胞瘤、高血压、心肌梗塞等相关疾病,与人类的健康密切相关。因此,检测生物体中儿茶酚胺类神经递质的含量具有重要的意义。但是,生物体中儿茶酚胺类神经递质的含量比较低以及对温度、光比较敏感,因此,儿茶酚胺类神经递质的检测方法应该具有一定的选择性和灵敏度,同时应该具备一个快速、简便的样品处理方法,这样才能够对其进行快速、准确地定量。而现有的检测方法大多数存在着以下缺点,如操作步骤繁琐、灵敏度不够以及检测仪器昂贵、不易普及,因此开发研究出一个同时检测生物体中儿茶酚胺类神经递质的快速灵敏、可靠地方法具有非常重要的意义。
　　左旋多巴与卡比多巴是目前治疗帕金森病最有效的组合,但是长期使用会出现不同症状的并发症,最常见的为“剂末效应”和“开关效应”,这些并发症可能与左旋多巴在体内浓度的波动有关。目前临床上为了控释这种波动症状,最常用的方法是让患者服用左旋多巴-卡比多巴控释片(息宁,规格200/50 mg),但是控释片其释药特点往往会影响左旋多巴的吸收速度,导致起效时间延长,经常需要与速释片联用才能达到较好的治疗效果。因此,目前开发了一种左旋多巴和卡比多巴的缓释制剂(现处于Ⅲ期临床实验阶段),希望能够将左旋多巴的浓度快速稳定在一定的水平上,从而降低或消除由于长期使用而导致的症状波动等副作用。对于这种制剂在人体中疗效的研究,建立一个同时检测病人血浆中左旋多巴和卡比多巴的快速简便的方法至关重要,而现有的方法存在的缺点有成本高,选择性差,样品制备过程复杂以及分析时间长。因此建立一个快速方便、灵敏度高、选择性好的方法同时检测人血浆中左旋多巴和卡比多巴,对于指导临床上治疗帕金森病的合理用药以及开发新剂型具有重大的意义。
　　化学发光是近几十年来快速发展起来的一种分析方法,其分析灵敏度高、仪器设备简单,特别是近年来发展起来的金属纳米粒子参与的化学发光分析,更加提高了分析的灵敏度,成为检测生物体中微量或痕量物质的一种重要工具。本课题组前期开发了一种新的高效液相色谱(HPLC)-在线纳米金催化鲁米诺-过氧化氢化学发光检测器,该检测器灵敏度高、选择性好以及线性范围宽,利用该技术同时对8种酚类物质进行了测定,检测限在0.53-0.97 ng/mL之间,相当于10.6-19.4 pg(进样量为20μL),并且成功地应用到―Cabernet Sauvignon‖干红葡萄酒中的酚类物质的检测。本论文将这种高灵敏度以及高选择性地联用技术应用到了神经递质以及脑部用药的分析。以儿茶酚胺类神经递质以及左旋多巴和卡比多巴为研究对象,探讨了这些物质对在线纳米金催化的鲁米诺-过氧化氢体系化学发光的影响,并对其机制进行了探讨,同时,利用HPLC-在线纳米金催化鲁米诺-过氧化氢化学发光检测器同时检测大鼠脑组织中儿茶酚类神经递质,以及药物制剂卡左双多巴控释片和人血浆样品中左旋多巴和卡比多巴的测定。具体研究工作如下:
　　第一部分高效液相色谱与在线纳米金催化的鲁米诺化学发光联用法同时测定儿茶酚胺类神经递质
　　本研究基于在线纳米金催化鲁米诺化学发光体系,建立了同时测定大鼠脑内儿茶酚胺类神经递质的快速简便的化学发光分析法。利用紫外可见吸收光谱和透射电镜(TEM),证明了本化学发光体系的实质是氯金酸、鲁米诺的溶解介质(碳酸盐缓冲液)和过氧化氢在线生成的纳米金催化鲁米诺–过氧化氢体系,同时也得出了儿茶酚胺类神经递质能够增加体系中纳米金生成的量从而增强体系发光的结论。实验同时研究了液相色谱条件,化学发光体系中的各反应物的浓度和多种儿茶酚胺类神经递质对化学发光体系的影响。结果显示,液相色谱条件在甲醇:0.2％磷酸为5:95的条件下等度洗脱,8.5 min内能够很好的将去甲肾上腺素,肾上腺素以及多巴胺分开。在最优条件下,本方法测得的去甲肾上腺素,肾上腺素以及多巴胺的检测限在1.32-1.90 ng/mL之间(S/N=3),相当于26.4-38.0 pg(进样量为20μL)。利用本法成功地测定了大鼠脑匀浆样品中儿茶酚胺类神经递质的含量,回收率在94.6%-106.5%之间以及精密度在1.3%-5.5%之间。
　　第二部分高效液相色谱与在线纳米金催化的鲁米诺化学发光联用法同时测定左旋多巴和卡比多巴
　　左旋多巴和卡比多巴组合是治疗帕金森病的首选药物,但是随着长时间的用药,患者会出现不同症状的并发症,最常见的症状为“剂末效应”和“开关效应”。可能是由左旋多巴血药浓度快速波动导致的,目前临床上为了控释这种波动症状,最常用的方法是让患者服用左旋多巴-卡比多巴控释片,但是控释片其释药特点往往会影响左旋多巴的吸收速度,导致起效时间延长,经常需要与速释片联用才能达到较好的治疗效果。近年来,正处于三期临床试验阶段的左旋多巴-卡比多巴缓释片因能在较长时间内稳定左旋多巴的血药浓度,从而很好地控制帕金森患者症状的波动。因此,建立一个快速简便、灵敏度高的方法同时检测血浆样品中左旋多巴和卡比多巴的方法,对于指导帕金森患者的合理用药以及开发新剂型具有重要的意义。本研究基于在线纳米金催化鲁米诺化学发光体系,建立了同时测定“息宁”药片以及人血浆中左旋多巴和卡比多巴的快速简便的化学发光分析法。该联用法采用0.2%磷酸(A相):甲醇(B相)=5:95的流动相等度洗脱,能够在10.5 min内将二者完全洗脱出来。实验同时对化学发光体系中的各反应物的浓度、流速以及电压分别进行了优化。在最优条件下,本方法测得的左旋多巴和卡比多巴的检测限分别为0.896、1.080 ng/mL(S/N=3),相当于17.92、21.60 pg(进样量为20μL),线性范围分别为2.24-448 ng/mL(r=0.9960)、4.32-1080 ng/mL(r=0.9964)。利用本法对“息宁”药片和人血浆样品中左旋多巴和卡比多巴含量进行测定。结果药片中左旋多巴和卡比多巴的平均回收率分别为100.5%和103.1%,RSD分别为2.4和4.0。人血浆中左旋多巴和卡比多巴的回收率在97.0%-103.5%之间以及精密度在0.5%-3.3%之间。

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前言

参考文献

第一部分 高效液相色谱-在线纳米金催化的鲁米诺化学发光联用法同时定量大鼠脑组织中的儿茶酚胺类神经递质

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 总结

参考文献

第二部分 高效液相色谱-在线纳米金催化的鲁米诺化学发光联用法同时检测左旋多巴和卡比多巴

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 样品的检测

5 总结

参考文献

全文总结

致谢

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