stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支气管平滑肌中的表达

摘要

目的:支气管哮喘是一种由气道上皮细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞及多种细胞组分参与的慢性气道炎症反应,此种气道慢性炎症为非特异性变应性炎症,以嗜酸性粒细胞浸润为主。以气道炎症为发生基础,气道黏膜水肿,分泌物增加,气道上皮损伤,支气管收缩,气道反应性增加,平滑肌细胞增生,细胞外基质增加,气道可逆性下降,导致气道重塑的发生,气道重塑是慢性气道炎症发展的必然结果,气道平滑肌细胞是哮喘发病、气道重塑的主要效应细胞。研究发现钙库调控钙离子内流(SOCE)在机体生理、病理活动中起着重要作用,参与调节钙信号转导及细胞的生长、迁移、增殖与分化,钙离子释放激活钙离子通道蛋白(orai1)和基质交感分子1(stim1)是构成SOCE的重要分子,与哮喘气道平滑肌细胞增殖存在密不可分的关系,本实验将通过免疫组化实验观察stim1和orai1蛋白在哮喘气道平滑肌细胞中表达水平的变化,以期证实构成SOCE的orai1和stim1与支气管哮喘的发生、发展存在的联系。
　　方法:按照随机分组的原则,将40只清洁级雄性SD大鼠分成2组,分别为哮喘组和对照组,每组20只,(1)哮喘组:于第1、8、15天分别予以无菌腹腔注射10％ OVA溶液1 ml(含100 mg OVA和100 mg氢氧化铝)进行致敏,于第16天起置于雾化罐中雾化吸入含有1%OVA的生理盐水1 ml,进行激发,每次30 min,共7 d,使其出现打喷嚏、喘息、呼吸急促或呼吸困难等表现。(2)对照组:用生理盐水代替腹腔注射及雾化吸入,吸入时间相同。最后一次雾化吸入后24 h内,用3%戊巴比妥(0.3 ml/100 g)腹腔注射进行麻醉后行开胸手术,收集肺组织及肺泡灌洗液(BALF),离心BALF后将沉淀细胞用改良牛氏血细胞计数板做细胞计数。将浸入4%甲醛溶液固定的新鲜肺组织,24 h后制作蜡块,后切片制作成肺标本切片。肺组织病理切片 HE染色判断哮喘模型是否建立成功,分析 BALF中的细胞总数及分类计数,应用免疫组化技术及彩色病理图文分析系统测定表达stim1和orai1蛋白阳性细胞平均光密度值。通过统计学方法对各组指标数据进行分析比较。
　　结果:肺组织病理切片HE染色镜下观察呈现大量炎性细胞(肥大细胞、肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等)浸润,支气管黏膜肿胀,杯状细胞增殖,肌层肥厚,气道上皮细胞下纤维化,支气管腔内可见黏液栓等,证实哮喘模型建立成功。哮喘组中大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显高于对照组,差异有统计学意义,分别是(110.70±27.56 vs50.00±19.77,P<0.05)、(28.80±5.07 vs5.5±2.64,P<0.05)、(7.8±2.25 vs1.6±1.08,P<0.05)。哮喘组大鼠支气管平滑肌表达 orai1蛋白阳性细胞平均光密度值明显高于对照组(0.099±0.025 vs0.072±0.014,P<0.05)。哮喘组和对照组大鼠支气管平滑肌表达stim1蛋白阳性细胞的平均光密度值无明显差异(0.093±0.025 vs0.088±0.017,P>0.05)。
　　结论:orai1和stim1介导的SOCE在支气管哮喘平滑肌增殖中起到重要作用,orai1蛋白在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中表达变化较 stim1蛋白明显,对支气管平滑肌调节作用可能更重要。

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1前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2药物及试剂制备

2.3仪器与设备

3 实验方法

3.1 哮喘模型建立及样本的留取与保存

3.2 BALF的沉淀细胞计数及分类

3.3制备肺组织石蜡切片

3.4 石蜡切片HE染色

3.5 肺组织标本orai1和stim1的测定

3.6统计学处理

4 结果

4.1大鼠肺部组织形态学观察

4.2支气管BALF涂片HE染色细胞计数

4.3 支气管平滑肌orai1和stim1表达

5 讨论

6目前存在的问题：

7结论：

参考文献

附录

致谢

综述