结直肠锯齿状病变中p16及MLH-1基因甲基化状态和蛋白表达的研究

摘要

[背景与目的]
　　新版WHO(2010)消化系统肿瘤分类中,将结直肠锯齿状病变定义为一种以上皮呈锯齿状结构为特点的病变,可分为增生性息肉(hyperplastic polyps,HPs)、广基锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)和传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)。HP为锯齿状病变中最常见的病变,约占80％~90%,根据组织学上的粘液类型分为微泡型HP(microvesicular hyperplastic polyp,MVHP)、富于杯状细胞型HP(goblet-cell rich hyperplastic polyp,GCHP)及黏液缺乏型HP(mucin-poor type polyp,MPHP)。SSA/P占锯齿状病变的15%~25%,根据细胞异型性分为伴/不伴有细胞异型增生型。TSA占锯齿状病变的1%~6%左右,研究表明TSA具有恶变为结直肠癌的潜能,但它的锯齿状癌变通路存在争议。锯齿状病变是继经典型腺瘤后最重要的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)癌前病变类型,具有发展为 CRC的恶性潜能。近年来新认识到它与部分散发性结直肠癌的发生紧密相关,被认为是CRC除“腺瘤-癌变”途径和“denove癌”途径之外的一种新途径,即锯齿状通路。有文献提出[8],锯齿状病变通路与DNA甲基化密切相关,锯齿状通路中关键的启动因素就是DNA甲基化。因此相关基因甲基化在锯齿状病变中的研究应当引起重视。
　　本文分别探讨锯齿状病变中的p16及 MLH-1基因的甲基化状态。p16基因定位于人类第9号染色体短臂21上,是一种重要的抑癌基因。 p16基因失活,可使细胞生长失去控制,导致肿瘤的发生、发展。甲基化所可引起的p16基因的沉默,是人类肿瘤中较常发生的基因改变。但目前有关锯齿状病变与 p16基因甲基化相关的研究很少。MLH-1是人类错配修复基因(mismatch repairgene,MMR)家族中的成员,是肿瘤错配修复基因中最为重要的基因,MLH-1基因启动子甲基化可使该基因沉默,是导致散发性 CRC MMR缺陷的主要原因[7]。新近的研究指出,锯齿状癌变通路可能有两条途径[4],其中一条称为无蒂(广基)锯齿状癌变途径,主要为BRAF基因突变,引起MLH-1基因甲基化和高水平CpG岛甲基化现象,最终导致腺体不同程度异型增生直至癌变。可见,MLH-1基因启动子甲基化是锯齿状病变恶变过程中的重要事件。
　　本实验通过Taqman探针实时定量PCR(MethyLight)和免疫组化方法检测结直肠锯齿状病变患者组织中 p16、MLH-1基因甲基化状态和蛋白表达情况,分析其甲基化状态和蛋白表达情况两者的相关性,从而探讨p16和MLH-1基因在锯齿状癌变通路中的作用及临床病理意义。同时研究锯齿状病变中p16和MLH-1基因启动子区甲基化状态和年龄因素的相关情况,探讨其在不同年龄层段基因甲基化程度。
　　[方法]
　　收集2007-01-01-2012-12-31其间北京军区总医院病理科结肠镜活检诊断为结直肠息肉和腺瘤的切片共4810例,由3名病理医师按WHO(2010)消化系统肿瘤分类进行多轮回顾性阅片。然后筛选出锯齿状病变标本225例作为实验组,其中包括96例HP、61例SSA/P和68例TSA;同时,收集同院同期的管状腺瘤(Tubular adenoma,TA)54例、69例CRC和正常结直肠组织42例作为对照;并收集其相关临床及内窥镜资料。提取组织DNA,然后进行亚硫酸氢钠修饰,采用Taqman探针实时定量
　　PCR(MethyLight)方法检测实验组和对照组中的p16和MLH-1基因启动子区甲基化状态,并通过测序法验证扩增的目的片段,同时应用免疫组化方法检测其中随机抽取的116例锯齿状病变(52例HP、41例SSA/P、23例TSA)、20例TA、24例CRC和24例正常结直肠黏膜组织中p16和MLH-1蛋白的表达水平,最后,用统计学方法,对p16和MLH-1基因甲基化状态与其蛋白表达水平及临床病理学资料进行分析。
　　[结果]
　　1.各组织p16基因启动子区甲基化状态、蛋白表达及两者相关性检测:p16基因启动子甲基化率在正常(2.38%)、HP(21.88%)、TA(35.19%)、SSA/P(42.62%)和TSA(52.94%)呈上升趋势。HP和正常组织、SSA/P、TSA及CRC有显著性差异(P<0.05),HP和TA差异性不显著(P>0.05);SSA/P与正常及HP有显著性差异(P<0.05);TSA与正常及HP有显著性差异(P<0.05),TSA、TA、SSA/P、CRC四者相互之间均无显著性差异(P>0.05)。各组织免疫组化 p16阳性表达率:p16蛋白阳性表达率在正常、TA、HP、SSA/P、TSA、CRC分别为91.67%、40.00%、44.23%、31.71%、21.74%、29.17%。正常组与HP、SSA/P、TSA、TA、CRC组之间有显著性差异(P<0.05),其余各组差异性都不显著(P>0.05)。各组织p16基因甲基化与p16蛋白相关性分析:TA、SSA/P、TSA、CRC四组中p16基因甲基化与其蛋白表达结果均有显著性差异(P<0.05),且相关性为负相关;HP中p16基因甲基化与p16蛋白表达结果无显著性差异(P>0.05),相关性为负相关;正常组织中无相关性。各组织 p16基因甲基化与年龄相关性分析:TA、HP、SSA/P、TSA四组中p16基因甲基化与年龄均有显著性差异(P<0.05),且相关性为正相关,相关系数分别为γ=0.303、γ=0.222、γ=0.576、γ=0.530。
　　2.各组织 MLH-1基因启动子甲基化状态、蛋白表达及两者相关性检测:MLH-1基因启动子甲基化阳性表达率在正常、TA、HP、SSA/P、TSA和CRC分别为9.24%、40.74%、22.92%、45.90%、61.76%和52.17%。HP与正常、SSA/P、TSA、CRC有显著性差异(P<0.05),SSA/P与正常有显著性差异(P<0.05),TSA与正常有显著性差异(P<0.05);HP和TA无显著性差异(P>0.05)。TSA、TA、SSA/P、CRC四者相互之间均无显著性差异。各组织 MLH-1蛋白阳性表达率分别为正常(100%)、HP(98.08%)、TA(80.0%)、SSA/P(75.61%)、TSA(69.57%)和CRC(70.83%)。正常与HP、SSA/P、TSA、TA、CRC之间有显著性差异(P<0.05),HP与TA、 SSA/P、TSA、CRC组之间有显著性差异(P<0.05),其余各组差异性都不显著(P>0.05)。各组织MLH-1基因甲基化与其蛋白相关性分析:TA、SSA/P、TSA三组中 MLH-1基因甲基化与其蛋白表达均有显著性差异(P<0.05),且相关性为负相关;HP和CRC中 MLH-1甲基化与其蛋白表达结果均无显著性差异(P>0.05),相关性为负相关;正常组织中无相关性。各组织 MLH-1基因甲基化与年龄相关性分析:TA、HP、SSA/P、TSA四组中MLH-1基因甲基化与年龄均有显著性差异(P<0.05),且相关性为正相关,相关系数分别为γ=0.475、γ=0.289、γ=0.450、γ=0.575。
　　[结论]
　　1.结直肠锯齿状病变组织中p16和MLH-1基因甲基化率在HP、SSA/P、TSA中逐渐上升,p16和MLH-1基因甲基化可能是诱导其蛋白表达减少的主要原因之一,且在锯齿状癌变通路中起重要作用,同时p16和MLH-1基因甲基化又可能与年龄相关,随年龄增长,甲基化程度越频繁。
　　2.结直肠锯齿状病变组织中p16和MLH-1基因甲基化率在HP、SSA/P、TSA中逐渐上升,SSA/P和TSA甲基化率与HP比较有统计学意义,因此,甲基化有助于HP和SSA/P、TSA的鉴别。
　　[背景与目的]
　　肿瘤是严重威害人类健康的重大疾患,其中结直肠癌是发病率上升最快的恶性肿瘤之一,发病率高居各种恶性肿瘤的第三位。结直肠癌的发生发展是一个多种基因参与的复杂过程,主要包括:抑癌基因的失活、基因组的超甲基化、癌基因的激活以及细胞间粘附功能的降低等。近年来发现DNA甲基化与结直肠癌发生发展密切相关,成为目前研究的热点。本文主要研究MLH-1和p16基因的甲基化与结直肠癌发生发展的关系。MLH-1是人类错配修复基因(mismatch repairgene,MMR)家族中的成员,是肿瘤错配修复基因中最为重要的基因,主要功能为参与调节细胞的周期,并且使DNA的复制能够正确的进行。p16基因是人类一种重要的抑癌基因,参与细胞周期调控,并在许多环节中起着关键性的“刹车”作用。若MLH-1和p16基因失活,均可使细胞生长失去控制,导致肿瘤的发生、发展。
　　在结直肠癌中,基因启动子区域 DNA甲基化是遗传外修饰调控的一种重要方式,它可引起基因表达沉默,从而下调基因表达,导致肿瘤的发生[1,2]。已有研究表明去甲基化药物5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza-CdR)可以通过抑制基因高甲基化状态而恢复多种基因的活性,具有潜在抗肿瘤作用[3,4]。本实验采用去甲基化药物5'-Aza-CdR作用于结直肠癌HT-29和LoVo细胞系后,分别检测 MLH-1和p16基因甲基化状态及其 mRNA和蛋白表达水平,验证其mRNA和蛋白表达水平是否恢复,探讨在结直肠癌发生发展过程中应用去甲基化药物对MLH-1和p16基因甲基化的抑制作用,可能具有抗肿瘤生长作用,以期为结直肠癌的预防、发生及治疗提供理论依据。
　　[方法]
　　1.体外培养结直肠癌细胞系HT-29、LoVo,选取生长状态良好的细胞接种于六孔板培养,应用不同浓度的5'-Aza-CdR(0.5、1.0、1.5μM)分别对两种细胞进行干预,并设置阴性对照组(仅加DMSO溶剂),每24小时更换新鲜培养基,连续作用72h后,分别提取细胞的DNA、mRNA和蛋白。
　　2.应用TaqMan探针实时定量PCR(Methylight)方法分别检测两种细胞株中MLH-1和p16基因启动子区甲基化状态,应用SYBR Green PCR法分别检测两种细胞株中MLH-1和p16基因mRNA的表达,并结合2-△△Ct法进行分析,应用Western-blot技术分别检测两种细胞株中MLH-1和p16基因蛋白表达,并结合平均光密度比值进行分析。
　　[结果]
　　1.结直肠癌HT-29和LoVo细胞系中MLH-1和p16基因甲基化状况:在阴性对照组(仅加DMSO溶液)和实验组(分别加0.5、1.0、1.5μM5'-Aza-CdR)中HT-29和LoVo细胞株中p16基因甲基化状态分别都为甲基化、未甲基化、未甲基化和未甲基化,MLH-1基因甲基化状态分别都为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。2.结直肠癌HT-29和LoVo细胞系中MLH-1和p16基因mRNA和蛋白表达水平均较对照组有上调,并且有药物浓度的依赖性。
　　[结论]
　　15'-Aza-CdR能够有效逆转结直肠癌HT-29和LoVo细胞系中MLH-1和p16基因甲基化状态,并且恢复其mRNA和蛋白的表达水平,从而可以证明结直肠癌HT-29和LoVo细胞系中MLH-1和p16基因甲基化可能是诱导其蛋白表达下调的原因之一。
　　25'-Aza-CdR通过恢复MLH-1和p16基因mRNA和蛋白水平的表达,可能具有抑制肿瘤生长作用,为结直肠癌的抗甲基化治疗提供了科学理论依据。

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实验一 结直肠锯齿状病变中p16及MLH-1基因甲基化状态与蛋白表达的研究

1 前 言

2 材料与方法

3 结 果

4 讨 论

5 结论

参考文献

实验二 5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对人结直肠癌HT-29和LoVo 细胞系中MLH-1、p16基因甲基化和基因表达的影响及意义

1 前 言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述

参考文献