H2S/EDHF及映山红花总黄酮对大鼠大脑中动脉平滑肌细胞BKCa通道的影响

摘要

内皮衍生超级化因子即EDHF（endothelium-derived hyperpolarizing factor），是继一氧化氮（nitric oxide,NO）、前列环素(prostacyclin,PGI2)之后的第三种具有自体活性的舒血管物质，研究发现在不同种属、不同部位的血管上都存在EDHF现象，EDHF的化学本质在不同的血管上存在差异，近几年研究表明，在大鼠脑血管上也存在EDHF现象，并且其化学本质被初步证实为H2S（hydrogen sulfide）。但对其舒张血管的分子机制尚不明确。映山红花总黄酮（total flavones of rhododendra,TFR）具有很好的舒张脑血管，抗脑中风作用，但其舒张脑血管平滑肌作用的机制尚不明确，其作用是否与H2S有关。本研究试图通过膜片钳等技术，分别观察H2S及TFR对大鼠大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）平滑肌细胞BKCa通道的影响，探讨了H2S和TFR舒张血管作用机制及两者可能的内在关系。
　　实验目的：
　　1.观察外源性H2S对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道电流和蛋白的影响，探讨H2S舒张脑血管的电生理和分子机制，为H2S作为脑血管EDHF提供理论依据；
　　2.观察TFR对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道电流的影响，从电生理角度探讨TFR的脑保护作用机制；
　　3.探讨H2S和TFR对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道影响的内在可能联系，进一步研究TFR的舒血管作用和H2S/EDHF的关系。
　　实验方法：
　　1.用酶解法急性分离大鼠MCA平滑肌细胞。
　　2.用全细胞膜片钳技术，记录大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道电流，并进行如下分组检测：
　　（1）选取适宜的平滑肌细胞，封接破膜，形成全细胞模式，向电极外液中依次加梯度浓度的NaHS，检测外源性H2S对BKCa通道电流的影响。
　　（2）选取另一组适宜的平滑肌细胞，形成全细胞模式，向电极外液中依次加梯度浓度的TFR，检测TFR对BKCa通道电流的影响。
　　（3）选取另一组适宜的平滑肌细胞，形成全细胞模式，通过PPG作用，探讨TFR对BKCa通道电流的影响与内源性H2S的关系。
　　3.原代法培养大鼠MCA平滑肌细胞，并用免疫组化方法进行鉴定。
　　4.用Western blot法测NaHS对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道蛋白含量表达的影响。
　　实验结果：
　　1.全细胞膜片钳实验结果表明，在急性分离的MCA平滑肌细胞上能记录到正常BKCa通道开放电流，并且此电流能被100 nmol/L浓度的BKCa通道特异性阻断剂IBTX所抑制；
　　2.全细胞膜片钳实验结果表明，梯度浓度的NaHS（10、100、500nmol/L）能激活MCA平滑肌细胞BKCa通道，且电流在一定范围内呈浓度依赖性的增加，此外NaHS对BKCa通道的激活作用能被IBTX特异性阻断；
　　3.全细胞膜片钳实验结果表明，梯度浓度的TFR（33.3，100，300 mg/L）可显著性增加MCA平滑肌细胞BKCa通道的电流（P0.001），100 nmol/L浓度的IBTX可以阻断TFR引起的BKCa通道激活。
　　4.全细胞膜片钳实验结果表明，MCA平滑肌细胞通过100?mol/L内源性H2S合成酶抑制剂PPG作用后，TFR仍能引起BKCa通道的激活。
　　5.平滑肌细胞免疫组化鉴定结果表明，细胞经显色后，细胞质着色,高倍镜下可见胞质内大量棕的纤维细丝,即平滑肌肌动蛋白丝。
　　6.western blot结果表明，与control组相比，NaHS各剂量组大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道蛋白表达无显著性差异（P0.05）。
　　结论：
　　1.H2S（EDHF）的舒张大鼠MCA作用机制涉及激活血管平滑肌细胞的BKCa通道的开放，对BKCa通道蛋白的表达无明显影响；
　　2.TFR能激活大鼠MCA平滑肌细胞的BKCa通道，这可能是TFR舒张脑血管，抗脑中风作用机制之一。

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1. 前言

2. 实验材料

2.1 实验动物

2.2 药品与试剂

2.3 试剂的配方

2.4 仪器与设备

3 实验方法

3.1大鼠MCA平滑肌细胞的急性分离

3.2全细胞膜片钳记录实验

3.3大鼠MCA平滑肌细胞的培养

3.4大鼠MCA平滑肌细胞的鉴定

3.5 western blot 法检测NaHS（外源性H2S）对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道蛋白表达的影响

3.6 统计学分析

4. 实验结果

4.1 大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道的特征电流及鉴定

4.2 NaHS（外源性H2S）对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道电流的影响

4.3 IBTX对大鼠MCA平滑肌细胞上H2S诱导的BKCa通道激活作用的影响

4.4 TFR对MCA平滑肌细胞BKCa通道电流的影响

4.5 TFR对MCA平滑肌细胞BKCa通道电流的影响与内源性H2S的关系

4.6 大鼠MCA平滑肌细胞的培养和鉴定

4.7 western blot 法检测NaHS（外源性H2S）对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道蛋白表达的影响

5 讨论

5.1大鼠MCA平滑肌细胞中的BKCa通道

5.2外源性H2S对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道的影响

5.3 TFR对大鼠MCA平滑肌细胞BKCa通道的影响及与内源性H2S的关系

6. 结论

参考文献

附录

致谢

综述: EDHF及其扩血管作用机制研究进展