母鼠孕期补充维生素D预防LPS诱发的神经管畸形

摘要

目的：前期研究证实，母体孕中期暴露细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可导致子代神经管畸形（Neural Tube Defects,NTDs）的发生。本研究探讨了母鼠孕期补充维生素D3（Vitamin D3,VitD3）对LPS诱发胎鼠神经管畸形的影响。
　　方法：成年的清洁级ICR小鼠（8w），自由饮食，在室温维持于20℃~25℃，昼夜节律均衡，且保持相对湿度45％～55%的环境中适应性喂养2周后，按雌雄比4:2于头一天晚上9:30合笼，次日清晨7:30检查雌鼠阴栓，以查到阴栓者视为交配成功，并定为妊娠第0天（GD0）。为探讨VitD3对LPS诱发胎鼠神经管畸形的影响，所有孕鼠均于GD0随机分为4组：单纯对照组（Control组），单纯VitD3补充组（VitD3组），LPS暴露组（LPS组）和LPS+VitD3组，每组15只。LPS组和LPS+VitD3组孕鼠均于GD8至GD12每天经腹腔注射给予25μg/kg的LPS，VitD3组和LPS+VitD3组孕鼠均于GD6至GD12每天经灌胃方式给予25μg/kg的VitD3。Control组给予等容量的生理盐水。GD18剖杀所有孕鼠，观察胎鼠外观是否存在畸形，统计活胎、吸收胎和死胎数，称量活胎鼠体重和胎盘重，测量活胎鼠身长，评价活胎鼠骨骼发育情况；为探讨VitD3对叶酸由母体转入胎鼠的影响，所有孕鼠均于GD0随机分为4组：Control组，VitD3组，LPS组和LPS+VitD3组，每组6只。LPS组和LPS+VitD3组孕鼠均于GD8至GD12每天经腹腔注射给予25μg/kg的LPS，VitD3组和LPS+VitD3组孕鼠均于GD6至GD12每天灌胃给予25μg/kg的VitD3。Control组给予等容量的生理盐水。末次LPS处理后12h剖杀所有孕鼠，取母鼠血清和胚胎，并采用电化学免疫发光法检测叶酸水平；为探讨VitD3对胎盘叶酸转运体基因和炎性细胞因子基因表达的影响，所有孕鼠均于GD0随机分为4组：Control组，VitD3组，LPS组和LPS+VitD3组，每组12只。LPS组和LPS+VitD3组孕鼠均于GD10经腹腔注射给予25μg/kg的LPS，VitD3组和LPS+VitD3组孕鼠于GD8至GD10每天灌胃给予25μg/kg的VitD3。Control组给予等容量的生理盐水。LPS处理后2h剖杀半数孕鼠，取母体血清、羊水和胎盘，ELISA法检测血清和羊水TNF-α和IL-6蛋白水平，real-time RT-PCR法检测胎盘炎性细胞因子和趋化因子基因表达水平。LPS处理后12h剖杀余下孕鼠，real-time RT-PCR法检测胎盘叶酸代谢酶和转运体基因表达水平。
　　结果：GD8－GD12连续给予5天的LPS后，20.3％胎鼠发生神经管畸形，且发生神经管畸形胎的孕鼠高达62.5%（10/16）。与对照组相比，LPS组胎鼠均重和胎盘均重均显著降低。LPS处理可引起胎鼠胸骨畸形、肋骨畸形和枕骨骨化不全。这些研究结果表明：母鼠致畸敏感期暴露低剂量LPS可诱发胎鼠神经管畸形，并导致胎鼠宫内生长受限和骨骼发育迟缓。进一步实验发现：LPS处理后，胎盘叶酸转运泵－质子偶联叶酸转运泵（pcft）和还原性叶酸载体1（rfc-1）基因表达显著下调，且发现LPS处理组胎鼠叶酸水平显著低于对照组；LPS处理后，胎盘tnf-α、il-1β、il-6等炎性细胞因子和mcp-1、kc、mip-2等趋化因子基因表达水平显著高于对照组，母鼠血清和羊水TNF-α和IL-6蛋白水平亦明显高于对照组。此外，母鼠孕期补充VitD3显著减轻LPS引起的母体和胎盘炎症；一致的是，补充VitD3显著对抗LPS下调pcft和rfc-1的基因表达，且明显减轻LPS引起的胎盘叶酸转运障碍；最为重要的是，母鼠孕期补充VitD3预防LPS诱发的胎鼠神经管畸形。
　　结论：母鼠孕期补充VitD3可通过抑制胎盘炎症并减轻胎盘叶酸转运障碍继而预防LPS诱发的胎鼠神经管畸形。

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1前言

2 材料和方法

2.1化学试剂

2.2维生素D配制

2.3 研究内容

2.4胎鼠发育指标测量和骨骼检查与评分

2.5胎盘总mRNA的提取和逆转录

2.6实时定量PCR（real-time PCR）

2.7酶联免疫吸附实验（ELISA）

2.8叶酸的检测

2.9统计分析

3结果

3.1补充维生素D3后对LPS暴露引起胎鼠外观畸形的保护作用

3.2孕期母体VitD3补充对LPS诱导的胚胎死亡和IUGR的影响

3.3母体孕期VitD3补充对LPS诱导的骨骼发育不全的影响

3.4孕期VitD3补充对LPS引起的母体血清和羊水中炎性细胞因子释放的影响

3.5孕期VitD3补充对LPS引起的胎盘炎性细胞因子和趋化因子基因表达上调的影响

3.6孕期LPS暴露和VitD3补充对母体叶酸水平及叶酸代谢的影响

3.7孕期母体VitD3补充对LPS引起的叶酸自胎盘向胚胎转运受损的影响

3.8孕期母体VitD3补充对LPS引起的胎盘叶酸转运泵表达下调的影响

4讨论

参考文献

个 人 简 历

致谢

综述: 维生素D及其受体的生理功能