复方芪参提取物经由TGF-β/TβR/Smad2/3抗肝纤维化-肝癌作用机制研究

摘要

慢性肝脏炎症，导致肝纤维化，继而发展为肝癌，是严重危害人类的难治性重大疾病。深入研究并揭示肝病的发病机制，尤其从细胞和分子水平阐明肝纤维化-肝癌发生过程，从而靶向干预特定的细胞和分子，是延缓或阻断肝病进程的新策略。肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC），被认为是各种致纤维化因素作用的直接靶细胞，其被激活进而异常合成分泌以胶原为主的细胞外基质（Extracellular matric，ECM）和自身细胞表型转化为肌成纤维细胞（Myofibroblast，MFB），从而导致肝脏的重构，是肝纤维化发生的中心事件。转化生长因子-β1（Transforming growth factor beta-1，TGF-β1），是被证实的最强有力的促肝纤维化细胞因子，由其介导的TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化和肝癌发病过程中被异常激活。本课题组前期研究表明，中药复方制剂复方芪参提取物（Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract，CASE）对四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）诱导的急性和慢性肝损伤都有明显的肝保护作用；近期研究发现CASE对二乙基亚硝胺（Diethylinitrosamine，DEN）诱导的肝细胞癌发生也有延缓和改善作用。
　　本研究通过整体实验（DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌模型）进一步观察CASE的抗肝纤维化-肝癌作用，并结合细胞实验（HSC和HepG2）深入探究其分子机制。
　　目的：
　　1.在前期已经证明CASE能改善肝功能相关血清学指标、降低肝癌发生率和多样性的基础上，通过苏木精-伊红染色对肝组织进行组织病理学分析，评估CASE对DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发生过程中组织病理学改变的影响。
　　2.观察DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌模型及CASE干预下，TGF-β1、I型TGF-β受体（TβRI）、II型TGF-β受体（TβRII）及Smad2/3磷酸化蛋白（pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L）水平变化，分析DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发病机制与TGF-β/TβR/Smad2/3信号转导的关系及CASE抗肝纤维化-肝癌作用与其关联性。
　　3.观察CASE对TGF-β1活化的HSC和HepG2细胞中TβRI、TβRII蛋白水平的影响，分析CASE对TβRI、TβRII是否有直接调控作用。
　　方法：
　　1.整体动物实验，观察 CASE对 DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的作用并探究可能的分子机制
　　成年雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、DEN模型组、CASE三个剂量组（60，120，240 mg/kg）及阳性药护肝片组（921 mg/kg）。DEN组、CASE组、护肝片组大鼠灌胃（ig）给予DEN（0.2％DEN10 mg/kg/次，每周5次），正常组给予等量的溶媒（5 g/L羧甲基纤维素-钠，即0.5%CMC-Na），共计14周；CASE组、护肝片组大鼠同时灌胃给予相应剂量的药物，正常组、DEN模型组给予相应溶媒（0.5%CMC-Na）处理，共计16周。分别于造模第12周、第16周两个时间点分批处死大鼠，收集肝脏组织，部分肝脏固定、石蜡包埋，制作组织芯片，苏木精-伊红（HE）染色观察肝组织的病理学改变；免疫组化染色法检测肝组织中TGF-β1、TβRI、pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L蛋白水平及组织中分布。部分肝脏低温冻存，分批解冻，提取细胞总蛋白，免疫印迹法（Western blot）检测肝组织中TGF-β1、TβRI、TβRII蛋白水平，以GAPDH为内参；免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）及免疫印迹法检测pSmad3C、pSmad3L蛋白水平，以Smad3为内参。
　　2.体外细胞实验，观察CASE对TGF-β1诱导的HSC、HepG2细胞中TβRI、TβRII蛋白水平的影响
　　体外培养HSC、HepG2细胞，取对数生长期细胞进行实验。实验分为溶媒对照组、TGF-β1组（40 pmol/L）、CASE三个剂量组（20，40，80μg/ml），于培养结束前24 h更换无血清培养基，CASE组加入相应剂量药物；培养结束前1 h，TGF-β1组、CASE组加入TGF-β1共培养，对照组加入等体积溶媒（不含血清的培养基）。培养结束后，收集细胞，提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测样本中TβRI、TβRII蛋白水平。
　　结果：
　　1、CASE延缓 DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌病理进程，并干扰TGF-β/TβR/Smad2/3信号转导
　　1.1、CASE对抗DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的病理改变
　　对照组大鼠肝脏表面光滑而有光泽、质地柔软，边缘锐利；肝小叶结构完整。DEN造模第12周大鼠肝脏表面粗糙呈颗粒状、质地硬，边缘变钝；肝小叶被胶原束包绕并分割，假小叶形成。造模第16周大鼠肝脏表面粗糙不平，形成大小不等的结节，经初步鉴定为癌结节；病理检测显示结节内肝细胞异型性明显，核大深染，证实为肝细胞癌。CASE治疗组大鼠肝脏病变有明显改善，表现在第12周肝硬化结节数目减少和纤维化程度减轻，第16周肝癌结节数目减少和肝癌细胞分化程度提高。
　　1.2、CASE降低DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中TGF-β1蛋白水平
　　DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中，TGF-β1蛋白水平持续上调，免疫组化检测显示，在癌旁组织、癌组织中皆可见TGF-β1蛋白高表达，而CASE呈浓度依赖性地降低TGF-β1蛋白表达。
　　1.3、CASE下调DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中TβRI蛋白水平
　　DEN造模第12周大鼠肝组织中，TβRI蛋白水平显著上调，而CASE呈浓度依赖性地降低TβRI蛋白表达；第16周，TβRI，在癌旁组织中呈现高表达，而在癌组织中微弱表达，CASE能够降低肝组织中TβRI蛋白表达。
　　1.4、CASE下调DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中TβRII蛋白水平
　　DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中，TβRII蛋白水平持续上调，而CASE呈浓度依赖性地降低TβRII蛋白表达。
　　1.5、CASE抑制DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中Smad2 C-末端和连接区磷酸化（pSmad2C/L）
　　DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中，pSmad2C、pSmad2L蛋白水平持续上调，尤其在癌前病变组织，而CASE三个剂量组，皆能显著抑制Smad2 C-末端和连接区的磷酸化。
　　1.6、CASE调控DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织中Smad3 C末端和连接区磷酸化（pSmad3C/L）
　　DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌发展进程中，pSmad3L蛋白水平持续上调、pSmad3C微有波动；CASE呈浓度依赖性地降低pSmad3L而升高pSmad3C蛋白水平。
　　2、CASE下调TGF-β1活化的HSC、HepG2细胞中TβRI、TβRII蛋白水平
　　在TGF-β1刺激下，HSC、HepG2细胞中，皆可见TβRI、TβRII蛋白表达增加，而CASE预处理组，可抑制或逆转由TGF-β1刺激引起的TβRI、TβRII上调现象。
　　结论：
　　1.CASE能显著延缓DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌的病理进程。
　　2.CASE抗肝纤维化-肝癌作用与调控细胞因子TGF-β1生成有关。
　　3.CASE可能直接靶向调控膜受体TβRI、TβRII而发挥抗肝纤维化-肝癌作用。
　　4.CASE降低pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L蛋白水平而升高pSmad3C蛋白水平，提示CASE抗肝纤维化-肝癌作用与调控Smad2/3 C末端和连接区磷酸化有关。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 CASE明显改善DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌组织病变

3.2 CASE干扰DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌进程中TGF-β1/TβR/Smad2/3信号转导

3.3 CASE下调TGF-β1活化的HSC中TβRI、TβRII蛋白水平

3.4 CASE下调TGF-β1刺激的HepG2细胞中TβRI、TβRII蛋白水平

4 讨论

4.1 CASE延缓DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌病理进程

4.2 CASE干扰DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝癌病变中TGF-β/TβR/Smad2/3信号转导

5 结论

6 下一步设想和展望

参考文献

附录一个 人 简 历

致谢

附录三 综述: 肝癌常用实验动物模型的建立