巨噬细胞糖皮质激素受体信号在小鼠皮肤伤口修复中的调控作用

摘要

研究背景：
　　创伤修复（wound healing）是生物医学研究领域中一个非常热点的问题。人们在炎症细胞、组织细胞、细胞因子、生长因子以及细胞外基质等方面都对创伤修复做了大量的研究，使我们对机体的这种复杂的生物学过程有了更进一步的认识。
　　巨噬细胞（macrophage）在创伤修复中的作用，尤其得到大家的关注，并对其做了深入的研究,认为巨噬细胞在创伤修复的各个阶段（炎症反应期、细胞增殖与肉芽形成期和组织重塑期）都发挥着十分重要的作用。没有巨噬细胞就不能完成创伤修复,或者巨噬细胞的功能发生障碍也会明显影响整个创伤修复的进程。
　　糖皮质激素(glucocorticoid，GC)作为一种抗炎和免疫抑制药物在临床上得到广泛的应用，然而长时间、大剂量或者不规范的使用也会带来一系列严重的不良反应和并发症，有时甚至影响生命。延迟创伤修复作为GC的一个不良反应在临床上和动物实验中早已被大家观察和认识到，虽然人们也做了初步的探索，但是到目前为止对其中的机制仍没有得到全面和详细的阐明。
　　基于上述研究背景，本文以小鼠皮肤伤口修复为实验模型，以地塞米松（dexamethasone，Dex）作为GC的经典代表，从巨噬细胞的角度探讨GC延迟伤口修复的作用及其机制。
　　第一部分糖皮质激素延迟小鼠皮肤伤口愈合与伤口局部巨噬细胞数目减少有关
　　目的：1.证实GC延迟小鼠皮肤伤口愈合；
　　2.证实GC减少小鼠皮肤伤口局部巨噬细胞数目；
　　3.研究GC对小鼠皮肤伤口局部组织及巨噬细胞的糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）水平的影响。
　　方法：小鼠皮肤伤口修复模型制作完成后，实验组和对照组分别用Dex和PBS处理，在大体水平每天测量伤口直径、隔天拍照伤口愈合情况；伤后第7天取两组小鼠皮肤伤口局部组织进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,在显微镜下观察测量伤口直径并拍照；伤后第7天分别用免疫组织化学法和流式细胞术对两组小鼠皮肤伤口局部组织巨噬细胞的数目进行检测；伤后第7天用Real-time PCR对两组小鼠皮肤伤口局部组织以及局部巨噬细胞的GR的mRNA水平进行检测。
　　结果：1.创伤后第6天和第9天实验组和对照组伤口直径分别为3.2±0.2mm,1.9±0.1mm（***，p＜0.001）和2.5±0.1mm,1.0±0.2mm（***，p＜0.001）；伤后第7天在组织学水平测量实验组和对照组伤口直径分别为3.2±0.2mm,1.2±0.4mm（**，p＜0.01）；可以看出实验组小鼠皮肤伤口愈合明显延迟。
　　2.用免疫组织化学法对伤后第7天伤口局部巨噬细胞数目进行检测，结果显示每个高倍镜视野下F4/80+(巨噬细胞的表面标志物)细胞数实验组和对照组分别为18.0±1.7,37.3±3.5（**，p＜0.01）；用流式细胞仪分析检测，得到一致的结果，即Dex可以明显减少伤口局部巨噬细胞数目。
　　3.对伤后第7天伤口局部组织以及局部巨噬细胞GR的mRNA水平进行检测，结果发现Dex可以显著提高伤口局部组织和局部巨噬细胞GR的转录水平。
　　结论：GC可以减少伤口局部巨噬细胞数目，从而延迟小鼠皮肤伤口愈合，并且可能是通过GR信号发挥作用的。
　　第二部分糖皮质激素通过抑制巨噬细胞迁移导致伤口局部巨噬细胞数目减少
　　目的：探讨GC导致小鼠皮肤伤口局部巨噬细胞数目减少的初步机制。
　　方法：首先我们用 ELISA法检测了实验组和对照组小鼠血清中趋化因子CXCL1,CXCL2的水平，并用流式细胞术对体外培养的两组巨噬细胞表面的趋化因子受体CXCR2的表达情况进行了检测。然后我们分别用经典的体内细胞迁移实验和体外Trans-well实验对Dex和PBS处理的巨噬细胞迁移能力进行了评估，并对迁移后巨噬细胞CXCR2的表达进行了检测，最后从形态学上对体外培养的两组巨噬细胞进行了观察。
　　结果：与对照组相比，实验组小鼠血清中CXCL1,CXCL2的水平明显降低；流式细胞术检测到体外培养的巨噬细胞趋化因子受体 CXCR2的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)实验组较对照组也明显减弱；体内细胞迁移实验和体外Trans-well实验对巨噬细胞迁移能力进行评估，结果发现Dex可以明显抑制巨噬细胞的迁移，另外对迁移后的巨噬细胞趋化因子受体CXCR2水平进行检测，结果显示实验组巨噬细胞CXCR2显著降低。体外培养的巨噬细胞形态学观察表明Dex可以抑制巨噬细胞伪足的生长。
　　结论：GC可能是通过下调CXCL1/2-CXCR2来抑制巨噬细胞的迁移，从而导致小鼠皮肤伤口局部巨噬细胞数目减少。
　　第三部分糖皮质激素通过糖皮质激素受体信号减少伤口局部巨噬细胞数目并延迟皮肤伤口愈合
　　目的：初步探讨 GC使伤口局部巨噬细胞数目减少，导致小鼠皮肤伤口愈合延迟的信号通路。
　　方法：我们采用了GR的阻断剂——米非司酮（mifepristone，RU486）阻断GC-GR信号通路后，再次进行了小鼠皮肤伤口修复实验。将小鼠分为三组:PBS组，每天腹腔注射PBS； Dex组，每天腹腔注射Dex溶液（5mg/kg）； Dex+RU486组，每天注射Dex溶液(5mg/kg)和RU486溶液（2mg/kg）。然后同第一部分，我们分别从大体水平和组织学水平评估小鼠皮肤伤口愈合情况，并用免疫组织化学法和流式细胞术检测伤口局部巨噬细胞的数目，同时检测伤口局部巨噬细胞GR的水平。
　　结果：从大体水平和组织学水平得到的结果均发现：Dex+RU486组小鼠皮肤伤口愈合速度明显较Dex组加快，几乎接近PBS组小鼠皮肤伤口愈合速度。免疫组织化学法和流式细胞术检测伤口局部巨噬细胞数目,结果显示：小鼠皮肤伤口局部巨噬细胞（F4/80+和CD11b+F4/80+细胞)数目Dex+RU486组和PBS组接近，都较Dex组显著增加。此外流式细胞术对伤口局部巨噬细胞GR的水平检测的结果显示：Dex+RU486组小鼠伤口巨噬细胞GR的MFI较Dex组明显减弱，而与PBS组无差异。
　　结论：GC确实是通过GC-GR信号抑制巨噬细胞迁移到创伤局部从而导致小鼠皮肤伤口延迟愈合。

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前言

第一部分 糖皮质激素延迟小鼠皮肤伤口愈合与伤口局部巨噬细胞数目减少有关

材料和方法

实验结果

讨论

第二部分 糖皮质激素通过抑制巨噬细胞迁移导致伤口局部巨噬细胞数目减少

材料和方法

实验结果

讨论

第三部分 糖皮质激素通过糖皮质激素受体信号减少伤口局部巨噬细胞数目并延迟皮肤伤口愈合

材料和方法

实验结果

讨论

全文小结

参考文献

附录

致谢

综述: 巨噬细胞在创伤修复中的作用