围生期十溴联苯醚暴露上调小鼠睾丸雌激素受体α致血睾屏障破坏的研究

摘要

目的：十溴联苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）作为一种重要的环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors, EEDs）被广泛用做阻燃剂添加于电器和生活用品中，是一种能够干扰体内激素的合成、分泌、运输、结合、作用、代谢的物质，具有神经、生殖、甲状腺和免疫毒性。因有研究表明多溴联苯醚的浓度与新生儿的体重呈负相关，减轻附睾重量，其表现出生命早期毒性作用，同时雌激素受体(estrogen receptor，ER)有调控睾丸支持细胞增殖的作用，故为研究睾丸雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)在围生期BDE-209暴露对F1雄性小鼠血睾屏障的破坏作用，使用ICR小鼠探讨BDE-209对睾丸ERα、Formin1、F-actin,血睾屏障（blood-testis barrier，BTB）相关蛋白（claudin-11，occludin, ZO-1）表达以及BTB结构破坏的影响；此外，使用BDE-209以及ERα的特异性抑制剂MPP（Methyl-Piperidino-Pyrazole）共同作用于SerW3细胞，检测ERα, Formin1, F-actin和BTB相关蛋白表达水平影响，阐明BDE-209通过上调睾丸ERα致BTB破坏及其分子机制。
　　方法：
　　动物实验中，取6周龄ICR雄鼠24只，雌鼠48只适应性饲养5天后，合笼取孕鼠，当天记为孕0天（GD0），按随机数字表法将小鼠分到对照组（玉米油100mg/kg BW组），BDE-209100 mg/kg BW组，BDE-209300mg/kg BW组，BDE-209500 mg/kg BW组。对妊娠（GD）7天后的F0母鼠进行经口灌胃BDE-209处理，每天清晨灌胃处理一次，连续灌胃至产后（PND）21天。每天清晨对F0孕鼠称重，纪录F0孕鼠致F1小鼠出生后21天F0孕鼠体重；记录PND1 F1小鼠窝仔数，以及PND1至PND35 F1小鼠体重。于PND35和PND105选取F1雄鼠，摘取小鼠眼球保留血样，待取血结束后选择颈椎脱臼处死，于冰浴上分离各脏器，将需制作组织形态学切片脏器按照相应条件储存，其余脏器立即放于液氮罐中速冻储存，并及时转移致-80℃冰箱储存，当需要对生物样品进行检测时取出，且禁止反复冻融。采用实时定量聚合酶链反应实验法，免疫蛋白印迹法，免疫荧光化学发光法以及免疫组织化学法检测小鼠睾丸ERα mRNA和蛋白表达改变，血睾屏障相关蛋白如 claudin-11，occludin，ZO-1mRNA与蛋白表达改变，以及Formin1和F-actin蛋白改变，。
　　选择SerW3细胞进行细胞实验，采用MTT方法检测24h不同浓度BDE-209（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml）和MPP作用后的细胞生存率，确定 BDE-209染毒剂量。当复苏或传代细胞生长状态稳定后，待细胞覆盖培养皿80%面积后加入 BDE-209与 MPP，此时细胞密度约为1×108，在BDE-209与MPP作用细胞24h后观察细胞形态学变化，免疫蛋白印迹法和免疫荧光方法检测ERα，Formin1, F-actin，血睾屏障相关蛋白(claudin-11，occludin，ZO-1)表达变化。
　　结果：
　　（1）围生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠体重与脏器系数改变：各BDE-209剂量组与对照组相比，不同时期体重均出现了不同程度下降（P<0.05）；F1雄性小鼠生殖系统的各脏器系数表现为：PND35时期，附睾的100mg/kg BW组与对照组相比，脏器系数上升，且差异有统计学意义（P<0.05），PND105时期睾丸：各BDE-209组与对照组相比脏器系数下降，且差异有统计学意义（P<0.05）；
　　（2）围生期BDE-209暴露上调F1雄性小鼠睾丸ERαmRNA, ERα蛋白且MPP抑制BDE-209上调SerW3细胞ERα蛋白表达：与对照组相比，PND35时期的500mg/kg BW组的ERαmRNA表达上调（P<0.05）；而PND105时期F1小鼠的300mg/kg BW组，500mg/kg BW组的ERα表达上调（P<0.05）；通过免疫组织化学法观察雄性F1小鼠睾丸组织中ERα的表达水平，PND35时期300mg/kg BW与500mg/kg BW组睾丸中ERα表达明显增加；PND105时期500mg/kg BW组睾丸中ERα表达明显增加；细胞实验中SerW3细胞的BDE-209组的ERα蛋白的表达量明显高于对照组（P<0.05）；
　　（3）围生期BDE-209暴露下调F1雄性小鼠睾丸Formin1且MPP抑制BDE-209下调SerW3细胞Formin1表达：PND35时期300mg/kg BW组，500mg/kg BW组与对照组相比，Formin1表达下调（P<0.05）；而PND105时期小鼠的所有BDE-209组的Formin1的表达明显低于对照组（P<0.05）；细胞实验中SerW3细胞的BDE-209组的Formin1的表达明显低于对照组（P<0.05）；
　　（4）围生期BDE-209暴露下调F1雄性小鼠睾丸F-actin且MPP抑制BDE-209下调SerW3细胞F-actin表达：PND35时期的F-actin的表达变化为300mg/kg BW组，500mg/kg BW组与对照组相比，表达下调（P<0.05），细胞实验中 SerW3细胞的各个BDE-209组的F-actin的表达明显低于对照组（P<0.05）；
　　（5）围生期BDE-209暴露下调F1雄性小鼠睾丸BTB相关蛋白的mRNA与蛋白表达且MPP抑制BDE-209下调SerW3细胞BTB相关蛋白表达： PND35与PND105两个阶段的claudin-11 mRNA：300mg/kg BW组，500mg/kg BW组表达明显低于对照组（P<0.05），而ZO-1与occludin分子的mRNA的表达为只有PND35时期各BDE-209组的表达明显低于对照组（P<0.05）； PND35时期的claudin-11：500mg/kg组相对于对照组表达下降（P<0.05），而在PND105时期，300mg/kg BW组，500mg/kg BW剂量组表达低于对照组（P<0.05）；PND35与PND105时期ZO-1300mg/kg BW组，500mg/kg BW组表达量均显著低于对照组（P<0.05）；occludin PND105时期BDE-209的300mg/kg BW组，500mg/kg BW组表达明显低于对照组（P<0.05）;细胞实验中BDE-209组的claudin-11，occludin的表达量与对照组相比，明显较低（P<0.05），其余BDE-209组claudin-11, occludin的表达量相对于对照组差异无统计学意义,而ZO-1表达量在BDE-209组与对照组间无差异。
　　（6）围生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠组织形态学指标：HE切片发现两个时期小鼠的睾丸组织的曲系精管出现不同程度损伤以及精子数目的改变，超微电镜中各剂量组中紧密连接结构出现了不同程度的破坏，Sertoli细胞内细胞器也出现不同程度改变。
　　结论：十溴联苯醚可以引起睾丸组织以及睾丸支持细胞SerW3细胞系中ERα表达上升，Formin1，F-actin以及血睾屏障紧密连接相关蛋白表达下调，并且引起睾丸组织中支持细胞紧密连接破坏，提示BDE-209通过上调ERα表达破坏小鼠血睾屏障。

目录

声明

英文缩略词表

1 前言

2 材料与方法

2.1实验器材与实验试剂

2.2 实验动物与细胞

2.3动物与细胞处理

2.4 SerW3细胞MTT实验检测细胞生存率

2.6 实时定量聚合酶链反应实验(PCR，Real-time polymerase chain reaction)

2.7 免疫蛋白印迹实验方法

2.8免疫组织化学实验（immunohistochemical）

2.9 免疫荧光化学发光法（Immunofluorescence chemiluminescence）

2.10睾丸组织形态学观察

2.11统计学处理

3 结果

3.1围生期BDE-209暴露致F1雄性小鼠体重与脏器系数改变

3.2 BDE-209与MPP共处理SerW3细胞生存率的改变

3.3 BDE-209处理SerW3细胞的细胞形态学损伤

3.4围生期BDE-209暴露上调F1雄性小鼠睾丸ERα mRNA与ERα表达且MPP抑制BDE-209上调SerW3细胞ERα表达

3.5 围生期 BDE-209 暴露下调 F1 雄性小鼠睾丸 Formin 1 表达且 MPP 抑制BDE-209下调SerW3细胞Formin 1表达

3.6围生期BDE-209暴露下调F1雄性小鼠睾丸F-actin表达且MPP抑制BDE-209下调SerW3细胞F-actin表达

3.7 围生期BDE-209暴露下调F1雄性小鼠睾丸血睾屏障相关蛋白mRNA及蛋白表达且MPP抑制BDE-209下调SerW3细胞血睾屏障相关蛋白表达

3.8围生期BDE-209暴露对小鼠睾丸组织形态学损伤

4 讨论

4.1 PBDEs的拟雌激素效应及雄性生殖毒性

4.2 ERα对雄性生殖能力影响

4.3 BTB对雄性生殖能力影响

4.4 Formin1在影响BTB结构与功能过程中作用

4.5 综述小结

5. 结论

参考文献

附录

致谢

综述：调控血睾屏障结构和功能的关键蛋白/通路的研究进展