Sunitinib经STAT3通路抑制LPS诱导树突状细胞表达PD-L1的实验研究

摘要

目的：
　　研究分子靶向药物舒尼替尼（sunitinib）对肾癌患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）表面表达的共抑制分子程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及疱疹病毒侵入介体（HVEM）表达的影响以及探讨sunitinib是否经过STAT3信号通路调控DC表面共抑制分子的表达变化，为sunitinib联合DC免疫治疗提供一定的理论依据。
　　方法：
　　体外诱导培养肾癌患者外周血单核细胞来源的 DC,随机分为 sunitinib联合 LPS组、LPS组、STAT3通路特异性阻断剂JSI-124联合LPS组及DMSO组。Sunitinib联合LPS组用200 ng/mL sunitinib预处理DC12 h，再用1μg/mL脂多糖（LPS）刺激24h；LPS组用1μL/mL DMSO预处理12h，再用1μg/mL LPS刺激24h；JSI-124联合LPS组用500 nmol/mL JSI-124预处理12h，再用1μg/mL脂多糖（LPS）刺激24h；DMSO组用1μL/mL DMSO作用36h。倒置显微镜观察各组形态变化；台酚蓝染色法检测各组 DC活性；流式细胞仪检测各组 DC表型 HLA-DR、CD83及 CCR7表达变化和DC表面共抑制分子PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及HVEM表达水平；蛋白印迹实验（Westren blot）检测各组STAT3蛋白及磷酸化-STAT3蛋白（p-STAT3）的变化。应用SPSS19.0软件分析，所有数据以均数±标准差（-x±s）表示，方差齐性检验（Levene检验）后，进行两样本 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.倒置显微镜观察发现，随着培养时间的增长，可见各组贴壁细胞呈集落生长，逐渐增大，细胞逐渐呈半悬浮状态，细胞体积变大，形状不规则，表面突起明显。经LPS诱导24h后，sunitinib联合LPS组和LPS组的细胞显著增大，毛刺状更明显，表现为典型的“树枝状”形态，而JSI-124组联合LPS组的细胞显著变大变圆，毛刺状不明显，且细胞均呈悬浮状态。另外，DMSO组的DC形态变化不明显。
　　2.通过台盼蓝染色法检测各组 DC活性，根据公式：活细胞率（％）=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100％，计算得出，与LPS组相比，各组活细胞率均无明显差异。
　　3.流式细胞术检测结果显示，本研究DC的百分比为79.92%，获得了较高纯度的DC；各组DC表型CCR7、CD83、HLA-DR分析：与LPS组相比，sunitinib联合LPS组和DMSO组的CCR7百分比显著减低（P＜0.01）;sunitinib联合LPS组的CD83百分比高于LPS组，而LPS组明显高于DMSO组（P＜0.01）；另外，在各组表达HLA-DR的平均荧光强度中，sunitinib联合LPS组和 JSI-124联合LPS组均无显著差异，而DMSO组明显低表达（P＜0.01）。各组DC共抑制分子分析：相比较LPS组，sunitinib联合LPS组表达的B7-H4百分比和PD-L1、CD80平均荧光强度均显著减低（P＜0.01,P＜0.05，P＜0.01），而PD-L2、CD86及HVEM平均荧光强度却无明显差别；JSI-124联合LPS组表达PD-L1的平均荧光强度降低（P＜0.05），CD80、CD86、PD-L2、B7-H4及HVEM无显著差异；DMSO组的各共抑制分子 PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H4及 HVEM均呈低水平表达（P＜0.01）。
　　4. sunitinib联合LPS组、JSI-124联合LPS组及DMSO组的p-STAT3蛋白灰度比分别为1.24±0.11、0.51±0.1、0.02±0.004均低于LPS组2.1±0.3，而STAT3蛋白灰度比无明显变化。
　　结论：
　　1. LPS诱导肾癌患者外周血单核细胞来源的 DC快速成熟，sunitinib不影响 DC的形态变化。
　　2. LPS促进DC表达抑制性信号，而sunitinib降低LPS诱导DC的共抑制分子PD-L1、CD80及B7-H4的表达，抑制表达部分抑制性信号。
　　3. Sunitinib抑制LPS诱导DC的STAT3信号通路活化。
　　4. STAT3通路调控LPS诱导DC表达PD-L1。
　　5. Sunitinib可能经STAT3通路抑制LPS诱导DC表达共抑制分子PD-L1。

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英文摘要

1 前言

2材料和方法

2.1 主要试剂

2.2主要仪器设备

2.3试剂的配制

2.4细胞来源

2.5实验方法

2.6统计学分析

3结果

4.1体外诱导DC形态特征

4.2 DC活性鉴定

4.3各组DC的CCR7, CD83 和HLA-DR的表达情况

4.4各组DC表达共抑制分子的变化情况

4.5 Western blot 检测DC胞内P-STAT3及STAT3蛋白的变化

4讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述:STAT3在肿瘤放化疗不敏感和免疫耐受中的作用