九种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立

摘要

目的：发热伴出疹性疾病（RFIS）是以发热和出疹为主要临床症状，伴有全身或局部皮肤及粘膜出疹，并可能引发其他临床症状的一系列疾病的总称，包括麻疹、风疹、伤寒、猩红热、流行性出血热、斑疹伤寒、流行性脑脊髓膜炎、水痘、带状疱疹、天花等，已经列入我国重点监测的传染性疾病的范畴之内。导致该类疾病的病原体包括病毒和细菌两大类，主要有麻疹病毒、肠道病毒、风疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、水痘-带状疱疹病毒以及溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。这些病原体多数在潜伏期或临床症状不明时已具有传染性。目前发热伴出疹性疾病的检测方法主要有分离培养、PCR法和免疫学诊断法，这些方法均不能满足同时检测多种病原体的需要。本文研究目的是建立一种能准确、同时、快速的检测九种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的方法，即肠道病毒71型、登革热病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌、伤寒沙门氏菌。
　　方法：通过文献调研确定待检测的病原体及其病原体的靶基因，从每个病原体靶基因的高度保守区序列中设计引物与探针，并筛选出特异性的引物和探针。进行多重不对称PCR扩增，将带有标记的扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交，经洗涤，化学发光显色后进行结果分析。优化多重PCR体系、扩增条件、杂交条件以及化学发光检测条件后，评价该芯片的特异性、重复性和灵敏度。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测肠道病毒EV71梯度稀释的核酸，比较两种方法的灵敏度。并利用该方法对74例发热伴出疹性疾病的实际临床样本进行检测以评价其实用性。
　　结果：完成了九种发热伴出疹病原体基因芯片检测方法的建立。1.根据流行病学统计的调研结果最终确定九种待检测的病原体：麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、肠道病毒71型、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组β型溶血性链球菌和伤寒沙门氏菌。共筛选出了11条特异性检测探针和9对特异性扩增引物。2.构建了这九种病原体的质粒参考品，并成功构建了麻疹病毒、风疹病毒、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、登革热病毒这五种RNA病毒的体外转录RNA参考品。3.优化后的多重PCR体系分为A、B两管，在优化好的多重PCR体系、杂交条件以及检测条件下，该芯片显示出良好的重复性、特异性以及灵敏度。4.质粒参考品和体外转录 RNA参考品的最低检测限均达到3×103copies/反应，芯片法比实时荧光PCR法的灵敏度低10倍，但芯片具有明显的高通量优势。5.74例临床样本的检测灵敏度为95.00%，检测特异性为100.00%，总符合率为95.95%。
　　结论：本文建立了一种能同时检测九种发热伴出疹病原体的化学发光检测基因芯片的方法，并经过初步验证该检测方法具有良好的特异性、重复性和灵敏度，为发热伴出疹的流行病学研究及其临床诊断提供了一种高通量、高效率的筛查手段。

目录

声明

缩略词表

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1待检测病原体和相应靶基因的确定

3.2引物和探针的筛选

3.3质粒参考品的构建

3.4多重PCR/RT-PCR体系的优化

3.5基因芯片的特异性评价

3.6基因芯片的灵敏度评价

3.7基因芯片的重复性评价

3.8临床样本的检测

4.讨论

5.结论

参考文献

附录

在读期间的学习成果

致谢

综述:发热伴出疹性疾病的病原学及检测方法研究进展