IL-37调节巨噬细胞极化抑制宿主肝脏血吸虫虫卵肉芽肿和纤维化的机制研究

摘要

血吸虫病（Schistosomiasis）是一种严重危害流行区人民健康和阻碍社会经济发展的热带病。该病主要分布于亚洲、非洲及拉丁美洲的76个国家和地区，患病人数达2亿以上。血吸虫病也是威胁我国人民健康的重要寄生虫病，截至2015年底，据推算全国共约有7.7万血吸虫病人。虽然监测资料显示全国血吸虫病疫情有下降趋势，但血吸虫病流行环节复杂、影响因素众多，我国血吸虫病防治工作仍面临诸多严峻挑战。因此，有效预防和治疗血吸虫病仍是当前研究的热点和难点。
　　血吸虫病的主要危害是虫卵肉芽肿病变和继发性肝纤维化。巨噬细胞(Macrophage，M)是肉芽肿组织的主要细胞成分，也是固有免疫的重要成分，同时还作为抗原递呈细胞启动并调节获得性免疫应答，在虫卵肉芽肿及纤维化形成和发展中发挥关键作用。虽然血吸虫虫卵肉芽肿的形成由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和肝星状细胞等的共同参与，但是巨噬细胞发挥着重要的调节作用，巨噬细胞的极化状态显著影响肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的发生、发展和转归，从而显著影响血吸虫感染后对宿主的致病及其后果。尤其M2型巨噬细胞对宿主度过血吸虫病急性期至关重要，若能早期抑制M1型巨噬细胞的过度活化使其尽早向M2型极化，阻止炎症重症化，或可为临床干预免疫炎症导致肝纤维化的发生发展提供新的靶点和依据。
　　控制血吸虫病患者的炎症反应和适度抑制虫卵肉芽肿的形成，巨噬细胞正是一个理想的靶向目标。已有研究提示，巨噬细胞的极化过程是可逆的，巨噬细胞的表型和功能的改变可能受局部一些细胞因子环境调控。只是目前在虫卵肉芽肿和纤维化发生发展的不同时期，到底是哪些因素触发巨噬细胞的表型和功能发生变化，尚未见系统深入的研究。全面了解血吸虫虫卵肉芽肿和纤维化发生发展中巨噬细胞的表型及功能改变原因，早期抑制 M1型巨噬细胞的过度活化并/或使其尽早向M2型极化，阻止炎症重症化，将为减轻或抑制肉芽肿炎症反应和肝纤维化提供新的思路。
　　白细胞介素-37（Interleukin-37，IL-37）是IL-1家族的新成员，又被称为IL-1F7。IL-37是近年来发现的一种能够调节固有免疫和获得性免疫应答的细胞因子，在各种炎性疾病和免疫性疾病中具有抑制炎症作用。IL-37在可多种细胞中表达，主要表达于巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞、组织上皮细胞、滑膜细胞、间质细胞、腺细胞、角质形成细胞和树突状细胞等。成熟的IL-37可分泌到细胞外与细胞表面SIGIRR和IL-18Rα两个受体亚基结合通过受体途径进行免疫负调控作用；另外成熟的IL-37还可进入A549细胞和THP-1细胞的细胞核，与Smad3蛋白相互作用，通过核转录因子途径抑制免疫应答。以往研究表明IL-37对巨噬细胞具有免疫调节作用，但IL-37是否影响巨噬细胞的极化以及作用机制目前尚未报道。
　　我们推测在血吸虫感染时，IL-37可能抑制M0极化为M1型巨噬细胞并介导M0较早向M2极化，从而抑制或减轻虫卵肉芽肿引起的宿主过度的炎症反应，使宿主顺利度过血吸虫感染急性期反应并减轻后期肝纤维化的发生和发展。
　　由于市售的IL-37细胞因子的设计没有体现其转录因子的作用，该细胞因子的成药性可能被低估，而且不能从转录因子角度研究IL-37。为了深入研究IL-37如何抑制宿主血吸虫肝纤维化的作用及其机制，本课题组主要成员美国Antagen制药有限公司研发总监及我校兼职教授高闻达自主设计并制备了转染人CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO细胞株和no CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO细胞株。通过该两株细胞的培养，得到并纯化出真核细胞表达的 CPP-IgG2Fc-IL-37和 no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白。其中 hIL-37为人 IL-37蛋白；CPP为细胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP），有助于蛋白进入细胞内发挥作用；带有IgG2Fc mut是为了避免产生ADCC或者CDC，延长IL-37蛋白的体内半衰期并有利于蛋白纯化；同时还在CPP-IL-37和IgG2Fc之间设计了带有WEHD氨基酸序列的caspase-1酶切位点。这样CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白可从细胞外通过CPP的作用转导进入细胞内。进入细胞后，在caspase-1作用下使IL-37脱离IgG并能将IL-37递送至细胞核内，发挥转录因子功能。也就是说 CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白既能递送细胞表面信号又能递送细胞内及核因子信号。而no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白因为没有细胞穿透肽，也没有蛋白酶切割位点，因此 no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白仅与细胞表面 IL-37受体结合而活化该受体信号通路。IL-37蛋白带有CPP及Ig融合蛋白的原创性设计，其通过细胞表面膜受体或兼具核转录因子通路的作用机制能够被充分研究。
　　为了进一步确认 IL-37是否能够通过诱导巨噬细胞表型转变从而改善宿主肝脏血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化的作用及其机制，本研究分为3个部分：一、检测血吸虫急性感染病人和正常人血清中IL-37的表达情况，初步探讨IL-37是否与血吸虫感染具有相关性；二、利用 C57BL/6小鼠制备日本血吸虫感染模型，在感染后24天始分别给予重组 IL-37(Recombinant IL-37, rIL-37)蛋白、CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白(以下简写为CPP-IL-37)和no CPP-IgG2Fc-IL-37(以下简写为no CPP-IL-37)直至第6周，研究IL-37是否通过调节巨噬细胞表型转变抑制宿主血吸虫虫卵肉芽肿形成及肝纤维化发展；三、在此基础上，进一步以正常小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，分别加入rIL-37蛋白、no CPP-IL-37蛋白、CPP-IL-37蛋白及Smad3抑制剂SIS3等共培养，探讨该IL-37蛋白对巨噬细胞向M1/M2极化的影响，并探讨IL-37对巨噬细胞极化的机制。
　　一、检测血吸虫急性感染病人和正常人血清中IL-37的表达情况
　　IL-37在炎性疾病和自身免疫性疾病的致病中扮演重要角色，且IL-37的表达水平与疾病的严重程度密切相关。本实验收集14份日本血吸虫急性感染病人血清和14份非流行区健康人血清，双抗夹心ELISA检测各组血清中IL-37的表达情况。结果发现健康对照组低表达IL-37，而急性日本血吸虫感染患者血清中IL-37的表达量明显升高（p<0.05）。该实验结果提示 IL-37作为一种抗炎性细胞因子，可能通过某种负反馈调节机制抑制炎症因子，与血吸虫病的发病及病程进展存在一定关系，可能在血吸虫虫卵肉芽肿反应中起到抑制过度炎症反应、保护宿主机体的作用。
　　二、观察IL-37处理后对小鼠肝脏血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化的影响
　　为了进一步明确 IL-37在日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿和肝纤维化病变中的作用，小鼠血吸虫感染后第24d开始通过尾静脉注射分别给予合适剂量的rIL-37、no CPP-IL-37或CPP-IL-37蛋白，每隔3d一次，于感染后42天剖杀小鼠，观察血吸虫感染小鼠经IL-37治疗后对处理肉芽肿炎症反应和肝纤维化的影响；并采用HE染色、Masson染色、qRT-PCR、FACS及免疫组化等技术从细胞、分子水平分析其机制。
　　结果显示：不同剂型的IL-37蛋白处理后对感染小鼠的虫荷、卵荷、肝脏重量没有明显影响。但肉眼可见IL-37处理组小鼠肝脏大体外观明显改善，肝脏表面虫卵结节减少；尤以CPP-IL-37蛋白治疗组肝脏外观改善最明显。HE染色结果显示不同剂型的IL-37蛋白处理组小鼠肝脏虫卵肉芽肿中浸润的炎性细胞明显减少，肝细胞坏死明显减轻，与感染对照组相比，发现IL-37处理组小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积明显减小(p<0.05）；尤以CPP-IL-37蛋白处理组肉芽肿面积减小最为明显，经统计学分析后三种不同的 IL-37处理组之间肝脏虫卵肉芽肿面积差异没有显著性（p>0.05）。不同剂型的IL-37蛋白处理组小鼠血清中转氨酶AST和ALT水平均明显低于感染对照组(p<0.05)；其中CPP-IL-37蛋白和no CPP-IL-37蛋白处理组肝功能损害减轻最为明显，rIL-37蛋白处理组肝功能损害恢复程度不如no CPP-IL-37蛋白和CPP-IL-37蛋白处理组(p<0.05）。同时发现不同剂型的IL-37蛋白处理组与感染对照组相比，肝脏胶原纤维的间隔减少并变细（p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白处理组的纤维化面积减少最为明显，IL-37蛋白处理组之间差别无统计学意义。接着我们通过免疫组化利用 anti-α-SMA多抗检测各组小鼠肝脏α-SMA的表达情况，发现不同剂型的IL-37蛋白处理后α-SMA蛋白的表达量比感染对照组显著减少(p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白处理组α-SMA的表达减少最为明显，三种IL-37蛋白处理组之间差别无统计学意义。而且不同剂型的IL-37蛋白处理组后与感染对照组相比小鼠肝脏组织中IL-17的 mRNA明显下调，而TGF-β的 mRNA水平明显上调(p<0.05）；更感兴趣的是巨噬细胞M1细胞因子iNOS的mRNA水平也明显下调，而巨噬细胞 M2细胞因子 Fizzl的 mRNA水平高于感染对照组(p<0.05）。FACS分析显示不同剂型的IL-37蛋白处理后与感染对照组相比肝脏虫卵肉芽肿细胞中 Treg细胞数和细胞比例明显多于感染组（p<0.05）；Th2细胞有所增多，而Th1细胞和Th17细胞有所减少，但感染鼠各组之间无统计学差异（p>0.05）；进一步分析发现，CPP-IL-37处理组 Treg细胞的比例显著高于其他 IL-37治疗组(p<0.05）。FACS分析同时还显示不同剂型的IL-37蛋白处理后与感染对照组相比，M2型巨噬细胞数和细胞比例明显增多（p<0.05），经 CPP-IL-37蛋白处理后 M2比例升高的最多(p<0.01)。
　　以上结果揭示 IL-37通过诱导巨噬细胞向 M2极化进而影响其下游效应细胞（Th细胞）功能从而抑制血吸虫虫卵肉芽肿反应和肝脏纤维化，保护宿主肝脏功能。
　　三、探讨IL-37诱导巨噬细胞向M2极化的作用机制
　　为了探究IL-37诱导巨噬细胞表型向M2转变的机制，在体外分离和培养正常小鼠腹腔巨噬细胞（M0），分别用100ng/ml的 rIL-37、20ng/ml的 no CPP-IL-37蛋白、10ng/ml的CPP-IL-37蛋白或10ng/ml的 CPP-IL-37蛋白+2μΜ的 SIS3与M0共培养12h。因CPP-IL-37蛋白带有CPP，有助于IL-37蛋白进入细胞及细胞核内发挥作用，为了观察CPP-IL-37蛋白作为核转录因子的作用，在该实验中加入Smad3的特异性抑制剂SIS3。FACS结果显示不同剂型的IL-37蛋白作用于M0后，M0极化为M2的细胞比例与PBS对照组相比均明显增多（p<0.01）；其中CPP-IL-37蛋白处理组诱导为 M2型巨噬细胞的比例最大，与其他三组相比差异具有显著性（p<0.05）。该实验结果说明 IL-37可通过细胞表面受体信号通路及核转录因子途径诱导巨噬细胞向M2极化。但M0预先用不同浓度的Compound C（AMPK抑制剂）处理后，CPP-IL-37蛋白诱导M0为M2的比例随着AMPK抑制剂浓度的增加逐步下降。免疫印迹结果显示用rIL-37、no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白诱导巨噬细胞12h后，pAMPK蛋白的表达均明显提高（p<0.01），尤其 CPP-IL-37蛋白处理组 pAMPK蛋白的表达量最高（p<0.01），经 SIS3抑制后 pAMPK的表达量与rIL-37和no CPP-IL-37蛋白处理组基本相似（p>0.05）。说明IL-37能够促进巨噬细胞内AMPK的活化，活化的AMPK能够促进巨噬细胞向M2极化，从而调控机体过度的炎症反应。
　　总之，本研究首次描述了IL-37在急性血吸虫感染患者的血清中含量明显升高；C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后，经IL-37处理后小鼠的肝脏虫卵肉芽肿和肝纤维化程度明显减轻，小鼠肝脏和腹腔M2型巨噬细胞的比例明显增多；体外实验用IL-37诱导正常小鼠腹腔巨噬细胞向M2的极化的比例也明显增多，同时IL-37处理后明显促进巨噬细胞内AMPK的活化，Smad3能增强IL-37的抑炎功能。本研究还首次证明我们制备的CPP-IL-37蛋白使用较低的工作浓度却发挥了更好的作用效果。拥有自主知识产权的no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白不仅便于本课题的实施，通过不同剂型的比较，为今后开发IL-37-Ig融合蛋白作为原创性治疗因过度免疫活化造成的各类疾病，打下机理研究的基础。

目录

声明

中英文词汇对照表

1.引言

1.1 研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 科学假说的提出及课题研究设想

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3.结果

3.1 IL-37在急性血吸虫感染患者血清中含量明显升高

3.2体内实验证明IL-37能够抑制小鼠肝脏血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化

3.3体内实验证明IL-37通过诱导巨噬细胞向M2极化从而减轻小鼠肝脏血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化

3.4体外实验证明IL-37蛋白通过促进AMPK磷酸化诱导巨噬细胞向M2极化

4.讨论

5.结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:IL-37在天然免疫和炎症疾病中的作用进展