右美托咪啶对糖氧剥夺/再灌注诱导神经细胞凋亡的保护作用

摘要

背景：
　　右美托咪啶（Dexmedetomidine，Dex）是一种高选择性、高特异性的α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、催眠、麻醉和镇痛作用，其α2：α1受体亲和力之比为1620：1。在大量临床与基础实验中均发现右美托咪啶能够显著抑制神经细胞凋亡以及对发育中脑组织具有神经保护作用，但其在细胞分子水平的作用机制尚不十分清楚。内质网(endoplasmic reticulum，ER)应激作为真核细胞的一种保护性应激反应，也是ER内稳态亚细胞损伤的病理过程。诸如营养不足、钙浓度变化氧化应激、以及缺血再灌注损伤等生理病理情况均能诱导ER内蛋白质的错误折叠，诱发ER应激。作为启动细胞凋亡的重要途径之一，研究已表明ER应激参与了心、脑、肾等重要器官缺血再灌注损伤的病理生理过程。本实验旨在细胞水平观察不同浓度右美托咪啶对糖氧剥夺/再灌注诱导神经元细胞凋亡的保护作用，并探讨 ER应激在其神经保护作用中的潜在机制。
　　目的：
　　探索并研究Dex对OGD/R诱导神经细胞凋亡的保护作用。
　　方法：
　　应用10μM全反式维甲酸（ATRA）3天和80nM十四烷酰佛波醇乙酯酸（TPA）3天序贯诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。根据预实验结果，将诱导分化后的SH-SY5Y细胞糖氧剥夺（OGD）12h，再灌注（R）12h构建OGD/R模型模拟临床缺血再灌注损伤。在OGD初期加入Dex，将分化的神经元细胞分为D0（0μM）、D1（0.1μM）、D2（1μM）、D3（10μM）、D4（100μM）、D5（1000μM）6组。再灌注12h后，用MTT法检测细胞存活率，流式细胞凋亡法检测细胞凋亡水平，以观察不同浓度Dex对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。选择神经保护效果确切组，应用WesternBlot法检测ER应激特异性蛋白—中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）以及促凋亡蛋白caspase-3和CHOP的表达。
　　结果：
　　1.ATRA与TPA序贯诱导SH-SY5Y向成熟神经元分化。
　　与正常未处理的SH-SY5Y细胞相比，经ATRA处理3天的SH-SY5Y细胞极性明显，胞体两端伸出又细又长的轴突样突起；继以TPA再处理3天后SH-SY5Y细胞则进一步向神经元表型分化，不仅细胞两端的突起更加伸展粗壮，亦在细胞间形成广泛的突出间联系，呈成熟神经元的细胞表型，而且其增殖明显受到抑制细胞数量少于正常未处理的细胞。
　　2.OGD12h/R12h神经元细胞存活率接近50%。
　　与4h/12h、8h/12h、16h/12h不同时间OGD/R处理相比，MTT法检测显示：神经元细胞的存活率随着 OGD时间的延长而逐渐降低。OGD4h/R12h的存活率为89.63%±2.77，OGD8h/R12h的存活率为81.68%±3.86，OGD12h/R12h的存活率为53.13%±1.54，OGD16h/R12h的存活率为21.24%±1.49。该结果表明，OGD12h/R12h的存活率接近50%，可作为构建OGD/R模型的标准时间。
　　3.10μM Dex显著提高OGD/R诱导后神经元细胞活力并抑制细胞凋亡。
　　Dex处理OGD12h/R12h诱导的细胞后，MTT法检测显示：D0组细胞存活率为52.15%±0.96，D1组细胞存活率为51.72%±1.96，D2组细胞存活率为51.97%±0.39，D3组细胞存活率为64.78%±2.76，D4组细胞存活率为45.69%±2.30，D5组细胞存活率为19.93%±4.22。D3组较D0组与其余各组死亡率明显下降，存活率显著提高（P<0.05）。流式细胞凋亡检测显示结果与MTT法检测结果一致。该结果表明，10μM Dex可以显著提高OGD/R诱导的神经元细胞存活率，并抑制神经元细胞的凋亡。
　　4.10μM Dex调控内质网应激相关蛋白的表达。
　　根据MTT法和流式细胞凋亡检测结果，本实验选择Dex终浓度为10μM组进一步的研究Dex的神经保护作用机制与ER应激、MANF及促凋亡蛋白的关系。Westernblot法检测显示：与D0组相比，10μM Dex显著上调了MANF的表达（P<0.01），并抑制了促凋亡蛋白caspase-3和CHOP的表达。
　　结论：
　　Dex在10μM终浓度时对OGD/R诱导的神经元细胞凋亡具有保护作用，并显著提高了细胞存活率。Dex神经保护作用的机制可能与上调 ER应激特异性蛋白MANF，抑制凋亡蛋白caspase-3和CHOP的表达相关。

目录

声明

英 文 缩 略 词 表(Abbreviation)

1.引言

2.实验材料与方法

2.1细胞株

2.2抗体

2.3主要试剂与耗材

2.4主要设备与仪器

2.5主要试剂及溶液配方

2.6 细胞培养与药物诱导分化

2.7 诱导后细胞免疫荧光

2.8 糖氧剥夺再灌注OGD/R模型的构建

2.9 右美托咪啶处理后细胞存活率MTT检测

2.10 右美托咪啶处理后细胞流式细胞凋亡检测

2.11 免疫印迹法检测内质网相关蛋白的表达

2.12 统计学方法

3.结果

3.1 ATRA与TPA序贯诱导SH-SY5Y向神经元分化

3.2 ATRA与TPA序贯诱导SH-SY5Y向神经元分化后Neun染色情况

3.3 OGD12h/R12h SH-SY5Y细胞存活率接近50%

3.4 10μM Dex抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

3.5 内质网应激相关蛋白表达

4. 讨论

5. 结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:右美托咪啶神经保护作用机制的研究进展