内质网应激在间歇性低氧小鼠血管内皮功能障碍中的作用

摘要

背景：
　　阻塞性睡眠呼吸综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一种常见的睡眠呼吸障碍性疾病，是在睡眠过程中反复发生的阻塞性低通气或呼吸暂停。间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）被认为是 OSAS的主要特征和重要损伤机制，是引发一系列心血管疾病的关键因素。内质网应激在许多病理生理刺激下（如氧化应激、缺血、缺氧）都可以发生，尤其是参与 OSAS相关的疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、缺血性心肌病等的发生。内皮细胞凋亡与 OSAS患者的血管内皮功能障碍密切相关。除了细胞死亡受体和线粒体依赖的细胞凋亡途径，内质网应激被发现是诱导内皮细胞凋亡的另一种途径。因此，我们推测间歇性低氧可以通过内质网应激介导血管内皮细胞损伤引起血管功能紊乱。
　　目的：
　　1.建立 IH小鼠模型，应用内质网应激抑制剂，观察 IH对小鼠血压和血管舒张功能的影响及IH小鼠胸主动脉中内质网应激相关蛋白的相对表达；
　　2.建立血管内皮细胞 IH模型，观察不同程度的间歇性低氧对细胞损伤的影响，并且研究内质网应激在不同程度间歇性低氧导致的细胞凋亡中的作用机制，为防治间歇性低氧导致的血管内皮功能障碍提供依据。
　　方法：
　　实验将雄性健康昆明小鼠分为正常对照（Control）组、间歇性低氧（IH）组和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）干预（IH+4-PBA）组，采用套尾法无创测量小鼠尾动脉收缩压（SBP），用血管张力测定技术（myography）检测小鼠胸主动脉的功能，采用蛋白免疫印迹实验（Western Bolt）的方法检测胸主动脉中GRP78和 CHOP蛋白表达情况。细胞实验将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分为正常培养（IH0 h）组、IH6 h组、IH12 h组和IH24 h组，并且对每组应用内质网应激抑制剂4-PBA，用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞的活力，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的含量。
　　1.内质网应激在间歇性低氧诱发小鼠血压升高中的作用
　　将雄性健康昆明小鼠分为正常对照（Control）组、间歇性低氧（IH）组和间歇性低氧4-PBA干预（IH+4-PBA）组，IH组和 IH+4-PBA组放入低氧仓进行间歇性低氧处理，每天8 h，连续28 d，间歇性低氧处理最后一周给予小鼠腹腔注射4-PBA（100mg/kg/d），Control组不放入低氧仓，其余条件和处理组相同。28天后采用套尾法无创测量小鼠尾动脉收缩压（SBP）。
　　2.内质网应激在间歇性低氧引起的小鼠血管内皮功能障碍中的作用
　　采用离体血管张力测定的方法检测三组小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张和内皮非依赖性舒张变化情况，观察小鼠动脉的舒缩功能变化。
　　3.间歇性低氧对小鼠胸主动脉中内质网应激相关蛋白表达的影响
　　采用 Western Bolt法检测三组小鼠胸主动脉内质网应激相关蛋白 GRP78和CHOP蛋白的表达水平。
　　4.内质网应激在间歇性低氧对人脐静脉内皮细胞活力影响中的作用
　　将HUVECs正常培养12 h后，换成无血清培养液。设IH0 h组、IH6 h组、IH12 h组和 IH24 h组，并且对每组应用内质网抑制剂4-PBA（2 mmol/L），用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞的活力，观察间歇性低氧及应用内质网应激抑制剂4-PBA对细胞活力的影响。
　　5.内质网应激在间歇性低氧对人脐静脉内皮细胞凋亡影响中的作用
　　将HUVECs分为IH0 h组、IH6 h组、IH12 h组和IH24 h组，并且对每组应用内质网抑制剂4-PBA，用流式细胞仪检测细胞的凋亡变化情况。
　　6.内质网应激在间歇性低氧对人脐静脉内皮细胞内eNOS含量影响中的作用
　　用 ELISA法测量各组细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的含量，观察间歇性低氧和4-PBA对内皮细胞产生的eNOS含量的影响。
　　结果：
　　1.间歇性低氧可以导致小鼠血压升高，其作用可被4-PBA抑制。
　　2.间歇性低氧可以导致小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张减弱，4-PBA可改善 IH小鼠的胸主动脉内皮依赖性舒张功能；内皮非依赖性舒张无差异。
　　3.间歇性低氧导致小鼠胸主动脉 GRP78表达下降，4-PBA导致其表达增加，CHOP蛋白表达增加，4-PBA导致其表达下降。
　　4.间歇性低氧可以使HUVECs活力下降，其作用可被4-PBA抑制；
　　5.间歇性低氧6 h细胞凋亡没有发生变化，长时间间歇性低氧（12 h和24 h）使细胞凋亡增加，应用4-PBA可以抑制间歇性低氧导致的细胞凋亡；
　　6.长时间间歇性低氧（12 h和24 h）可以使内皮细胞产生的 eNOS含量减少，其作用可被4-PBA抑制。
　　结论：
　　间歇性低氧可引起血管内皮细胞内质网应激，引起细胞凋亡、细胞 eNOS水平降低和血管舒张功能减退，导致血压升高。

目录

声明

英文缩略词

1 前 言

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3实验设计与分组

2.4统计分析

3 实验结果

3.1 内质网应激在间歇性低氧诱发小鼠血压升高中的作用

3.2内质网应激在间歇性低氧引起的小鼠血管内皮功能障碍中的作用

3.3 间歇性低氧对小鼠胸主动脉中内质网应激相关蛋白表达的影响

3.4内质网应激在间歇性低氧对HUVECs活力影响中的作用

3.5内质网应激在间歇性低氧对HUVECs凋亡影响中的作用

3.6 内质网应激在间歇性低氧对HUVECs内eNOS含量影响中的作用

4 讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述:内质网应激在心血管疾病中的作用

1. 概述

2. 内质网伴侣分子

3. 内质网应激途径

4. 内质网应激与心血管疾病

5.结语与展望

参考文献：