晚期糖基化终产物(AGEs)及可溶性受体(sRAGE)在冠心病患者冠脉侧支循环形成中的表达及意义

摘要

【背景】:
　　在糖尿病患者的研究中，晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)与细胞表面的晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation end-products，RAGE）相互结合起着抑制血管增生的作用。动物实验中也得出相同的结果[1，2]。但是，循环中可溶性 RAGE（soluble RAGE，sRAGE）因为能与细胞表面RAGE竞争性结合AGEs，阻断细胞表面RAGE与配体结合，从而sRAGE与AGE相互作用具有促进血管增生及促进冠脉侧支循环（coronary collateral circulation,CCC）形成的作用[3]。
　　目前，AGEs和sRAGE的研究主要限于糖尿病患者及糖尿病动物模型，尚未发现在糖尿病以外的人和动物的相关研究。本研究选择AGEs和sRAGE的原因是我们前期动物实验的蛋白芯片检测所用的动物模型是非糖尿病的侧支循环形成动物模型，而蛋白芯片结果却显示血浆中RAGE有高表达，可能说明AGEs和sRAGE相互作用不仅存在于糖尿病患者中，也可能广泛存在于非糖尿病患者中。
　　【目的】:
　　探讨AGEs和sRAGE在临床冠心病患者侧支循环形成良好与侧支形成不良中的表达水平及可能影响因素，目的是筛选出新的、更强的有促进侧支循环形成作用的分子生物学标志物，为冠心病诊疗提供新方法和理论依据。
　　【方法】
　　1.前期动物实验：结扎大鼠左前降支，建立侧支循环形成心肌缺血动物模型，用蛋白芯片检测侧支循环形成良好组及侧支循环形成不良组血浆蛋白表达差异，筛选出可能与侧支循环形成相关的蛋白因子，本研究主要在临床病人中扩大样本量进行验证检验。
　　2.临床标本采集与资料收集：按常规方法操作进行冠脉造影（Coronary angiography，CAG），血管穿刺成功后抽取动脉血,加入EDTA-K2抗凝管中。选取2ml全血标本分2管，低温-80度保存，余下血标本离心后取上层血浆分2管，低温-80度保存待检。
　　选取冠脉造影发现三大主支中至少有一支冠脉大分支(左前降支、左回旋支、右冠)狭窄≥90%的患者，分为冠脉侧支循环形成良好组、冠脉侧支循环形成不良组各30例；同时以冠脉造影显示无冠状动脉硬化者30例作为对照组。收集研究对象临床资料输入 SPSS21.0统计软件包中，包括患者年龄、性别、入院时血压、一般生化指标、高血压史、糖尿病史等等。
　　3.ELISA分析：定量检测血浆中AGEs及sRAGE的含量，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，操作严格按试剂盒说明书进行。
　　4.Western Blotting检测：另一管中血浆标本用Western Blotting检测AGEs和sRAGE水平。
　　（1）蛋白浓度测定：用Bradford比色法、紫外分光光度计检测，于A595处吸光值读取蛋白含量。
　　（2）蛋白质分离：本研究采用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离。
　　（3）电转移：本研究采用水浴式电转移。
　　（4）免疫检测
　　4.统计学分析：用SPSS21.0统计软件包进行数据统计，分析侧支循环形成良好、侧支形成不良及对照组患者血浆中AGE及sRAGE表达水平及差异，并分析其影响因素如心血管病危险因素、性别、年龄、血生化等指标。
　　【结果】:
　　1.在非糖尿病侧支循环形成心肌缺血动物模型中，用蛋白芯片检测发现血浆 RAGE高表达。
　　2. WB及ELISA验证检测结果均显示：在糖尿病及非糖尿病患者中，CCC形成良好组与CCC形成不良组的AGEs及sRAGE表达均高于正常对照组。对于糖尿病患者，与对照组相比，CCC形成良好组AGEs及sRAGE（AGEs：0.312±0.018 vs0.192±0.055，sRAGE：0.244±0.103 vs0.161±0.028）；及CCC形成不良组AGEs及sRAGE（AGEs：0.370±0.090 vs0.192±0.055，sRAGE：0.272±0.061 vs0.161±0.028）的表达水平均明显升高（P均＜0.05）。同样，对于非糖尿病患者，与对照组相比，CCC形成良好组AGEs及sRAGE（AGEs：0.361±0.032 vs0.167±0.021，sRAGE：0.235±0.061 vs0.133±0.013）；及 CCC形成不良组 AGEs及 sRAGE（AGEs：0.332±0.138 vs0.167±0.021，sRAGE：0.223±0.055 vs0.133±0.013）的表达水平也明显升高（P均＜0.05）。
　　而CCC良好组与CCC形成不良组比较，糖尿病及非糖尿病患者的AGEs及sRAGE表达则有所不同，在糖尿病患者，CCC形成良好组AGEs及sRAGE表达有低于CCC形成不良组倾向（AGEs：0.312±0.018 vs0.370±0.090，sRAGE：0.244±0.103 vs0.272±0.061），但差异均无统计学意义（P均＞0.05）；而在非糖尿病患者，CCC形成良好组AGEs及sRAGE表达有高于CCC形成不良组倾向（AGEs：0.361±0.032 vs0.332±0.138，sRAGE：0.235±0.061 vs0.223±0.055），但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。
　　3.单因素分析中，男性、高血压患者、hs-CRP水平越高、颈动脉内中膜厚度越厚、颈动脉斑块大小、冠脉狭窄程度，在三组之间的比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；多因素 Logistic分析：颈动脉斑块大小、冠脉狭窄程度与侧支循环形成相关，差异有统计学意义（P'＜0.05）。而年龄、吸烟史、糖尿病病史、MPV、脂蛋白a、LDL、胆固醇、甘油三酯水平、左房内径、室间隔厚度、左室后壁厚度、肺动脉高压、LVEF值与CCC形成无明显相关（P＞0.05）。
　　【结论】:
　　1.在非糖尿病动物试验中，蛋白芯片显示侧支循环形成良好组sRAGE表达增高；
　　2.本组资料显示：在糖尿病及非糖尿病冠心病患者中，CCC形成良好组与CCC形成不良组血浆AGEs、sRAGE表达均显著增高，提示AGEs、sRAGE可能与侧支循环形成相关；亚组分析显示，在糖尿病患者中，血浆AGEs、sRAGE表达与CCC分级呈负相关关系倾向，而在非糖尿病患者中，AGEs、sRAGE表达与CCC分级呈正相关关系倾向，但差异均无统计学意义，其机制不明，是否与样本量较小有关，有待进一步研究；
　　3.本组资料显示：男性、高血压、hs-CRP水平越高、颈动脉内中膜厚度越厚、颈动脉斑块大小、冠脉狭窄程度，与CCC形成密切相关，而颈动脉斑块大小、冠脉狭窄程度是CCC形成的独立影响因素。
　　4.CCC形成与冠脉狭窄程度有关，说明CCC多见于严重冠心病患者中，血管狭窄越重，越易形成CCC。

目录

声明

英文缩略词表

1.前言

2.材料与方法

2.1、研究对象

2.2、经伦理委员会（上海）批准，获得书面知情同意书

2.3、冠状动脉造影及标本采集

2.4、ELISA检测样品中AGEs、sRAGE的含量：采用双抗体夹心法。

2.5、Western Blotting检测

2.6、统计分析

3.结果：

3.1 蛋白芯片

3.2 ELISA测定血浆AGEs含量和sRAGE含量数据分析

3.3 AGEs、sRAGE WB检测结果及半定量分析

3.4 CCC良好组、CCC不良组及对照组三组之间一般资料的对比：

4 讨论

4.1. 冠心病的治疗方法及促进侧支循环形成的意义

4.2 影响侧支循环形成临床因素：

5 结论

6 参考文献

附录

本人简历

学习和工作经历

硕士期间研究成果

致谢

课题综述:晚期糖基化终产物（AGEs）在心血管疾病中的研究进展