携载BMP4基因的核壳结构纳米粒子修复兔桡骨临界骨缺损的研究

摘要

背景及目的：骨缺损常因创伤、感染、肿瘤等所致，传统的治疗方法如自体骨移植、异体骨移植或非骨性材料等并发症多且效果不理想。因此，研究者们将骨组织工程与基因治疗技术结合，探讨能够在体外安全有效缓释并表达目的基因的载体。最近研究表明，壳聚糖（CS）也可以作为基因载体，其具有独特的生物安全性和生物相容性，可与基因形成稳定的纳米粒子，在体内缓慢降解而缓释基因。骨形成蛋白（BMP）在骨修复及骨再生中起着非常重要的作用，BMP4蛋白是BMP家族中重要的蛋白之一，具有诱导骨细胞分化和促进新生骨的形成作用。本研究旨在探究修饰后的壳聚糖包裹BMP4基因形成的核结构及核壳结构在体外转染效率及体内对兔桡骨临界骨缺损的修复作用。
　　方法：巯基烷基化壳聚糖（TACS）与BMP4质粒通过正负电作用形成核结构，外包裹聚乙二醇修饰羟丁基壳聚糖（EG-HBC）形成壳结构，对HEK293T细胞进行体外转染，Western blot，免疫荧光实验探索核及核壳结构的转染效率。构建兔子双前肢18mm完全性临界骨缺损模型，分别植入含有TACS@EG-HBC/pBMP4或TACS/pBMP4的明胶海绵，对照组仅植入单纯的明胶海绵。术后2、4、8、12周取标本做分别处理,检测缺损部位的大体标本、骨密度及骨矿物质含量、X线、HE染色、免疫组化法、生物力学。
　　结果：Western blot显示TACS@EG-HBC/pBMP4蛋白表达最高，免疫荧光结果示TACS@EG-HBC/pBMP4转染效率高于TACS/pBMP4组和对照组。大体标本示：TACS@EG-HBC/pBMP4/G组2周可见新生骨痂，4周缺损处骨痂接近桥接，中间有纤维组织，8周骨痂骨化并桥接，12周骨缺损完全骨化修复；骨密度及骨矿物质含量显著高于TACS/pBMP4/G组和G组； X线示：术后12周骨缺损处已完全修复，骨髓腔已再通；HE染色：4周时可见大量软骨细胞，后形成骨小梁相互连接成片，到12周时新生骨小梁相互连接成板层骨；免疫组化：BMP4棕色蛋白染色明显；生物力学测定：所形成的新生骨与正常骨组织生物力学无统计学差异。
　　结论：TACS@EG-HBC/pBMP4/G具有良好的缓释基因和成骨能力。

目录

声明

中英文缩略词表

1.引言

2.实验材料

2.1 材料

2.2 试剂及仪器

3.实验方法

3.1 HEK 293T细胞的培养

3.2 pBMP4的扩增与提取

3.3核壳结构（TACS/HBC-pBMP4-EGFP）的制备

3.4 体外转染实验

3.5免疫荧光

3.6蛋白免疫印迹实验（Western Blot）

3.7 动物模型的制备及成骨检测

3.8统计分析

4.结果

4.1 免疫荧光流式结果

4.2 Western blot结果

4.3 兔桡骨临界骨缺损的修复

5.讨论

6.结论

7.问题与展望

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:基因活性基质在骨再生中的应用