酸敏感离子通道1a抑制剂的设计、合成以及活性筛选

摘要

酸敏感离子通道（Acid sensing ion channels, ASICs），属于退化因子/上皮钠通道（degenerin/epithelial sodium channel, DEG/ENaC）超家族中的一员，在酸性条件下能够被H+活化，通道开放。到目前为止，在哺乳动物中至少有7个ASIC亚基（ASIC1a, ASIC1b, ASIC1b2, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3, ASIC4）已被克隆及鉴定。局部组织酸化可以激活ASICs，进而导致疾病的发生，ASICs很可能在组织酸化相关疾病中发挥关键作用。越来越多的研究表明，在ASIC亚基中，ASIC1a在伴随着局部组织酸化的疾病如肿瘤、炎症、癫痫及脑缺血等发生发展过程中扮演者重要角色，阻断ASIC1a具有一定程度的保护作用，而现在仍缺乏高效、选择性强的小分子ASIC1a抑制剂。为此，本研究通过先合成可能具有抑制ASIC1a的化合物，再以大鼠关节软骨细胞为研究对象，探讨化合物对大鼠关节软骨细胞中ASIC1a蛋白表达及功能的影响。
　　目的：
　　合成ASIC1a抑制剂（6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives）以及体外观察其对大鼠关节软骨细胞中ASIC1a表达及功能的影响。
　　方法：
　　1.以6-溴-2-萘甲酸为起始原料，通过适当的官能团转化及Heck反应来合成6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives，采用核磁共振氢谱（1H NMR）和高分辨质谱（HR-MS）对其结构进行确证。
　　2.使用II型胶原酶消化分离提取大鼠关节软骨细胞，将细胞分为正常组、溶剂DMSO组、化合物五个浓度组及阳性药阿米洛利（Amiloride）组，观察化合物对大鼠关节软骨细胞生存率的影响；软骨细胞被分为五组分别在pH7.4、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5的培养基中孵育以及于胞外酸化（pH6.0）刺激0 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h，观察两者条件下对软骨细胞中ASIC1a蛋白表达的影响，选取最适条件用于观察化合物对软骨细胞中ASIC1a表达的影响；使用激光扫描共聚焦显微镜观察胞外酸化（pH6.0）刺激下化合物对软骨细胞中[Ca2+]i水平的影响。
　　结果：
　　1.本实验合成了8个新型化合物，分别为：
　　5a：6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone；
　　5b：6-[2-(4-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5c：6-[2-(4-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5d：6-[2-(2-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5e：6-[2-(4-Methoxy-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5f：6-[2-(3-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5g：6-[2-(3-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5h：6-(2-p-Tolyl-vinyl)-naphthalene-2-amidrazone，1H NMR和HR-MS表明其结构正确。
　　2. MTT结果表明，除化合物5 h外，与正常组相比，其余化合物对大鼠关节软骨细胞生存率无显著性差异；Western Blot结果表明，1）与正常组相比，pH6.0与pH5.5能显著升高软骨细胞中ASIC1a蛋白的表达，二者之间无统计学差异，2） pH6.0刺激3 h之前ASIC1a蛋白表达逐渐升高，3 h之后逐渐降低，由此，选取pH6.0刺激3 h为后续实验条件，3）与pH6.0+DMSO组相比，除化合物5b外，其余化合物均能显著降低软骨细胞中ASIC1a蛋白的表达；激光共聚焦结果表明，化合物5a（25μM）、5c（50μM）、5d（25μM）、5e（50μM）、5g（25μM）、5h（50μM）均能降低胞外酸化（pH6.0）刺激下软骨细胞中[Ca2+]i水平，其抑制程度分别为33.37%、20.83%、52.07%、81.40%、59.51%、63.23%，大部分活性可能均优于Amiloride（100μM，抑制程度：23.49%），其中以化合物5e或5g的效果最好。
　　结论：
　　8个新型化合物被合成，大部分能够影响ASIC1a蛋白表达及功能，具有潜在的ASIC1a阻断作用，其中，以化合物5e或5g的效果最好（抑制程度分别为：81.40%（5e，50μM）及59.51%（5g，25μM））。结合ASIC1a在组织酸化性疾病包括类风湿性关节炎病理过程中的重要作用，研究结果可能为靶向组织酸化性疾病的药物设计提供一个新的选择。

目录

声明

中 英 文 缩 写 词 对 照

1 前 言

2 药物合成部分

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与讨论

3 活性筛选部分

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

4 结论

参考文献

附录个 人 简 历

致谢

综述:酸敏感离子通道抑制剂的研究进展