TCF1介导的Wnt/β-catenin信号通路促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

摘要

目的：Wnt/β-catenin信号通路是一种经典的Wnt信号通路，参与广泛的生物学过程，诸如细胞分化、增殖、生存、凋亡、黏附、肥大、老化。有研究表明，在分化早期阶段激活Wnt/β-catenin信号通路可促进小鼠胚胎干细胞向中胚层及心肌细胞分化，然而，Wnt/β-catenin信号通路促心肌细胞分化作用的具体机制仍不清楚。活化的Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的降解减少，大量β-catenin在细胞内聚集，稳定的β-catenin进入细胞核，与Tcf/Lef1转录子结合并激活下游靶基因的表达进而调控细胞生理特性，其中Tcf/Lef1家族中包括Tcf1、Tcf3、Tcf4和Lef1。因此，本研究主要探讨Wnt/β-catenin信号通路中Tcf/Lef1转录子在小鼠胚胎干细胞（mESCs）向心肌细胞分化中的作用。
　　方法：首先采用悬浮一步培养法形成拟胚体（EBs）,在EBs形成后第2天至第5天加入CHIR99021，命名为CHIR99021组；在EBs形成后第2天至第5天加入Wnt3a，命名为Wnt3a组，将自动分化的EBs命名为对照组。采用qRT-PCR法检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达。运用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异性蛋白--肌球蛋白重链（α-MHC）、肌钙蛋白T（cTNT）及膜联蛋白43（CX43）的定位表达。采用 Western blot法检测α-MHC蛋白相对表达量。从而对比分析CHIR99021与Wnt3a在心肌细胞分化中的作用。然后使用PiggyBac vector（PB载体）构建PB-Tcf/Lef1载体以过表达Tcf/Lef1基因，将puromycin加入培养液中以筛选过表达细胞系；采用pLKO.1慢病毒载体构建Tcf/Lef1-shRNA载体，使用293T细胞进行病毒包被，将获取的病毒感染小鼠胚胎干细胞，再用puromycin筛选低表达细胞系。将获得的过表达/低表达细胞系通过悬浮一步培养法形成EBs，在EBs形成后的第7天将其贴壁培养，通过倒置显微镜观察其生长状态，采用 qRT-PCR法检测Brachyury、Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达。运用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异性蛋白--肌球蛋白重链（α-MHC）的定位表达。采用Western blot法检测α-MHC蛋白相对表达量。从而对比分析Tcf/Lef1转录子在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中作用。
　　结果：通过免疫荧光染色法我们发现胚胎干细胞源拟胚体中有心肌细胞特异性蛋白的定位表达，在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中，通过qRT-PCR法我们发现Brachyury在分化第7天达高峰，而后逐渐下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的基因表达量逐渐增加，第15天增加最显著，且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组；CHIR99021组优于Wnt3a组（*P<0.05，**P<0.01）。通过Western blot法我们发现 CHIR99021组和 Wnt3a组α-MHC蛋白表达量明显高于对照组，CHIR99021组高于Wnt3a组。我们使用PB载体过表达Tcf/Lef1基因，采用pLKO.1慢病毒载体低表达Tcf/Lef1基因，通过qRT-PCR和Western blot发现阳性细胞构建成功。随后我们发现过表达Tcf/Lef1细胞系在分化过程中Brachyury表达量在第7天达高峰，而后逐渐下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的基因表达量逐渐增加，第15天增加最为明显，且均高于对照组，其中 Tcf1最为显著（*P<0.05，**P<0.01）。通过Western blot法我们发现过表达Tcf/Lef1细胞系在分化过程中心肌细胞标志蛋白α-MHC相对表达量均高于对照组，且 Tcf1最为明显。相反，低表达Tcf/Lef1抑制了心肌细胞的分化，尤其是Tcf1的抑制作用较为明显。
　　结论：Wnt/β-catenin信号通路中Tcf1转录子可促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化，我们的研究将有益于提升胚胎干细胞在治疗心血管疾病中发展和应用。

目录

声明

英文缩略词

1.前言

2.实验材料与方法

2.1实验对象

2.2实验材料

2.3常用试剂的配制

2.4 实验方法

2.5 统计学方法

3.实验结果

3.1 小鼠胚胎干细胞的生长及拟胚体的形成

3.2 小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的形态学鉴定

3.3 CHIR99021可更为有效的促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

3.4 过表达Tcf/Lef1基因可在自我更新的环境下始动小鼠胚胎干细胞的分化

3.5 过表达Tcf1可明显促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

3.6 低表达Tcf1可抑制小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

4.讨论

5.结论

参考文献

附录个人简历

致谢

综述:Wnt信号通路对小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化作用的研究进展