二甲双胍对高原低氧认知损伤的保护效应及其作用机制的研究

摘要

大脑是对缺氧最敏感的器官。当从平原地区进入高原地区时，随着海拔升高环境中含氧量下降，大脑得不到充足的氧气造成脑组织损伤，继而引起感知、学习、记忆等认知功能的下降。因此，如何防治高原环境下认知能力的损伤成为亟待解决的问题之一。二甲双胍是目前治疗 II型糖尿病的一线药物。近年来一些研究发现，二甲双胍在多种疾病模型中，如阿尔茨海默、帕金森疾病，具有神经保护作用；同时，还能够改善缺血再灌注造成的脑组织损伤，以及促进成年小鼠脑内神经发生，提高反向的空间记忆等。关于二甲双胍对高原低氧造成的认知损伤是否具有保护作用尚未见报道。本研究观察了二甲双胍对高原低氧环境暴露导致的认知损伤的保护作用；并初步探讨了可能的作用机制。
　　实验结果如下：
　　1.二甲双胍对高原低氧认知损伤的保护效应及其作用机制的研究
　　1.1、二甲双胍预处理能显著改善大鼠的低氧暴露导致的认知损伤
　　急性低氧处理后大鼠学习记忆能力显著下降，水迷宫实验表现在低氧后大鼠潜伏期、穿越平台次数下降；新物体实验表现在大鼠对新物体识别指数显著下降。然而，经二甲双胍预处理能显著改善大鼠的低氧暴露导致的认知损伤。
　　1.2、二甲双胍对高原低氧造成的脑组织形态损伤的保护作用
　　急性高原低氧后大鼠出现显著的脑组织损伤，皮层和海马部位出现细胞肿胀，细胞间隙增宽、细胞核固缩深染、神经元数目减少等现象，而二甲双胍预处理后低氧组能有效逆转以上变化。该结果表明急性高原低氧可导致脑组织病理学损伤，二甲双胍可保护低氧造成的脑组织损伤。
　　1.3、二甲双胍及高原低氧处理对大鼠学习记忆相关基因表达的影响
　　二甲双胍预处理能显著逆转由急性低氧导致的JUNB基因转录上调，HOMER、PSD95基因转录下调。提示二甲双胍对高原低氧认知损伤的保护可能是通过对即刻反应基因、突触结构基因转录的调节来发挥作用的。
　　2.二甲双胍对PC12细胞低氧损伤的保护作用研究
　　2.1、低氧对PC12细胞的损伤效应
　　我们首先利用结晶紫染色和流式细胞仪观察了低氧对PC12细胞的损伤效应，结果发现，O2浓度为0.3%的物理低氧可对PC12细胞产生时间依赖性的损伤效应。
　　2.2、二甲双胍预处理对PC12细胞低氧损伤的保护作用
　　CCK8法测定细胞活力结果显示，二甲双胍预处理对低氧造成的PC12细胞损伤具有保护作用，在0.3mM和3 mM剂量范围内，其保护效应具有剂量依赖性。Annexin-V/PI染色并经流式分析发现，二甲双胍预处理对低氧诱导的细胞凋亡也具有抑制作用，二甲双胍联合低氧处理组细胞的凋亡率较单纯低氧组显著降低。以上结果表明，二甲双胍预处理对低氧诱导的PC12细胞损伤具有保护效应。
　　2.3、二甲双胍激活AMPK通路
　　我们采用蛋白印迹的方法观察二甲双胍对PC12细胞内AMPK激酶的活化情况。实验结果表明，二甲双胍处理细胞12 h后，细胞内的AMPK信号蛋白即被活化，表现在p-AMPK(Thr172)水平升高，这说明二甲双胍处理PC12细胞后，AMPK信号通路被激活。
　　2.4、 AMPK选择性抑制剂复合物C（Compound C）阻断二甲双胍的保护效应
　　进一步我们给予AMPK激酶选择性抑制剂复合物C预处理细胞1 h，然后再观察二甲双胍的保护效应。结晶紫染色和蛋白印迹实验结果证实，复合物 C处理后，二甲双胍对凋亡的抑制作用被阻断。
　　结论：
　　本研究首次发现了二甲双胍可以有效逆转高原低氧造成的大鼠认知能力损伤，并可改善低氧导致的神经元损伤，HOMER、PSD95等调控学习记忆相关基因可能参与了低氧下二甲双胍对认知损伤的保护作用。另外，体外实验也证实二甲双胍可以明显减少低氧PC12细胞的凋亡，AMPK激酶可能参与了二甲双胍对低氧下PC12细胞的保护效应。该研究明确了二甲双胍能有效预防在高原低氧引起的认知损伤，为其将来作为急性高原损伤防治药物提供了有力的实验依据。

目录

声明

中英文缩略词表

第一部分二甲双胍对高原低氧认知损伤的保护效应及其作用机制的研究

前言

材料与方法

1.1实验动物

1.2实验仪器和设备

1.3 主要试剂及配方

2、实验方法

2.1 实验动物分组

2.2 实验设计

2.3二甲双胍及高原低氧处理

2.4行为学检测

2.5大鼠灌流固定及脑组织石蜡切片

2.6 HE染色检测脑组织病理变化

2.7尼氏染色检测脑组织神经元数目及形态变化

2.8实时定量PCR检测mRNA表达

2.9数据处理及统计学分析

3 实验结果

3.1二甲双胍处理对大鼠体重的影响

3.2二甲双胍对大鼠高原低氧诱导的学习记忆损伤的影响

3.3二甲双胍及急性高原低氧处理对脑组织形态结构的影响

3.4 二甲双胍及急性低氧处理对大鼠学习记忆相关基因的影响

讨论

结 论（1）

参考文献

第二部分二甲双胍对PC12细胞低氧损伤的保护作用研究

前言

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

1.2细胞活力检测

1.3 结晶紫染色

1.4 细胞凋亡检测

1.5 蛋白印迹

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1低氧对PC12细胞的损伤效应

2.2二甲双胍预处理对PC12细胞低氧损伤的保护作用

2.3二甲双胍激活AMPK通路

2.4 AMPK选择性抑制剂复合物C（Compound C）阻断二甲双胍的保护效应

讨论

结 论（2）

参考文献

综述:二甲双胍改善认知障碍的研究进展

附录

致谢