乙酰胆碱酯酶在人牙周膜细胞中的表达和尼古丁与α-银环蛇毒素对其表达的影响

摘要

牙周炎以细菌诱发为始动因子，需在宿主、环境、遗传等因素共同作用下导致发病。大量研究已经证明，吸烟能极大地增加牙周破坏的风险，是牙周炎的危险因素。然而，到目前为止，吸烟对牙周组织的破坏机制、对牙周炎发生发展过程的影响仍不明了。尼古丁是烟草的主要成分，有学者推测，尼古丁可能在牙周炎的发生发展中起重要作用。　　非神经乙酰胆碱能系统包含：乙酰胆碱，乙酰胆碱酯酶，胆碱乙酰基转移酶，烟碱型乙酰胆碱受体和毒蕈碱型乙酰胆碱受体及乙酰胆碱转运体。研究认为，尼古丁作为烟草的主要化学物质之一，是非神经乙酰胆碱能系统中烟碱型乙酰胆碱受体的特异性配体。尼古丁与细胞膜上的烟碱型乙酰胆碱受体特异性结合后，经细胞内外信号转导，产生效应。也就是说，作为烟碱型乙酰胆碱受体特异性配体的尼古丁，可以代替乙酰胆碱，侵入局部非神经乙酰胆碱能系统的网络，发挥生物学效应。已有研究报道在人牙龈上皮细胞中存在非神经乙酰胆碱能系统。我们前期研究证实，人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts，人PDLF）中存在烟碱型乙酰胆碱受体，且尼古丁可上调该受体表达。然而，人PDLF中是否存在完整的非神经乙酰胆碱能系统，尼古丁是否通过该系统发挥作用，目前尚不清楚。　　本实验所用药物为尼古丁以及α-银环蛇毒素（α-BTX）。其中，α-BTX是烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型（α7nAChR）的特异性拮抗剂，能够特异性结合人体内α7nAChR。　　本研究采用细胞培养、免疫荧光、蛋白印迹等方法观察人PDLF中是否存在非神经乙酰胆碱能系统的另一重要成员—乙酰胆碱酯酶，以及尼古丁对该酶的影响，旨在从另一方面探讨尼古丁对非神经乙酰胆碱能系统的作用，有助于阐明吸烟相关性牙周炎发生发展的作用机制。　　第一部分：实验人牙周膜成纤维细胞的体外培养及鉴定　　1、主要方法：　　取因正畸治疗需要拔除的12-14岁健康人前磨牙，无菌条件下刮取根中1/3牙周膜组织，采用组织块法进行原代培养，待原代培养成功后，常规传代，免疫组化方法进行抗波形丝蛋白、抗角蛋白染色，显微镜下观察。　　2、主要结果：　　倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。细胞铺满培养瓶底，密度均匀，呈星形或长梭形，细胞胞浆均匀，细胞质丰满，细胞核为圆形，细胞排列呈旋涡状或放射状。免疫组化结果显示培养细胞抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色为阴性。　　3、主要结论：　　本实验所培养细胞为来源于中胚层的人PDLF。　　第二部分：实验免疫荧光检测人牙周膜成纤维细胞中是否表达乙酰胆碱酯酶　　正常人PDLF中存在乙酰胆碱酯酶，一定浓度的尼古丁可上调该酶蛋白的表达，α-BTX可拮抗其表达。结合前期和同期的实验结果，尼古丁的介入，改变了人PDLF中非神经乙酰胆碱能系统各成员的表达，打破了非神经乙酰胆碱能系统的平衡。由于该系统在疾病发生发展中起到一定作用，提示尼古丁很可能通过作用于该系统来影响牙周炎的发生发展。

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文献回顾

1 吸烟与牙周炎

2 乙酰胆碱酯酶

3 非神经乙酰胆碱能系统

正文

实验一 人牙周膜成纤维细胞的体外培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 免疫荧光检测人牙周膜成纤维细胞中是否表达乙酰胆碱酯酶

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 尼古丁及 α-银环蛇毒素对人牙周膜成纤维细胞中乙酰胆碱酯酶表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢