新型NAD+依赖性单体异柠檬酸脱氢酶的功能鉴定及辅酶特异性改造

摘要

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,简称IDH)家族蛋白属于β-脱羧脱氢酶超家族(β-decarboxylating dehydrogenase),主要催化异柠檬酸氧化脱羧,生成α-酮戊二酸、CO2和 NAD(P)H,为生物体提供能量和生物合成前体物质。在碳源贫瘠的环境条件下,IDH在三羧酸循环的碳通量分配中起重要调控作用。按照IDH亚基组成的不同,IDH可以分为四类,即单体IDH、同源二聚体IDH、同源四聚体IDH和异源寡聚体IDH;根据IDH的辅酶特异性,IDH可分为两类,即NAD+依赖性IDH(NAD-IDH)和NADP+依赖性IDH(NADP-IDH)。迄今为止,所有报道的单体IDH均为NADP+依赖性酶,单体NAD-IDH尚未见任何报道。
　　本研究克隆和高效表达了来自简明弯曲菌(Campylobacter concisus)的一种NAD+依赖性单体IDH(简称CcIDH),随后对6×His-标签的CcIDH进行了纯化。SDS-PAGE电泳显示CcIDH的亚基分子量约为65 kDa。进一步通过凝胶过滤层析,测得带6×His-标签的CcIDH重组蛋白活性状态的分子量为64.73 kDa。因此综合分析认为CcIDH为单体IDH。目前发现的单体NADP-IDH,分子量大小都在80-100 kDa。因此CcIDH的分子量明显偏小。氨基酸序列分析发现,CcIDH与已知的单体NADP-IDH的序列一致性不高。初步判断CcIDH是新型单体IDH。
　　在Mn2+和Mg2+存在条件下,纯化的重组CcIDH蛋白在55°C、pH7.8条件下表现出最大活性。热稳定性研究表明,在47°C条件下孵育20 min,酶活性下降50％左右。在Mn2+条件下,CcIDH对辅酶NAD+的催化效率是其对NADP+催化效率的88倍([kcat/Km]NAD/[kcat/Km]NADP),而在Mg2+条件下为596倍。因此, CcIDH对辅酶NAD+具有更高的亲和性。
　　在Mn2+或Mg2+条件下,CcIDH对NAD+的Km值分别为80.4μM和41.8μM,催化效率(kcat/Km)分别为0.379μM-1s-1和0.632μM-1s-1。CcIDH对NAD+的亲和力和催化效率均远低于单体NADP-IDH对NADP+的亲和力和催化效率,如棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii) IDH(Km=5.8μM; kcat/Km=15.9μM-1s-1)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) IDH(Km=4μM;kcat/Km=22μM-1s-1)。但是CcIDH对NAD+的亲和力和催化效率均远高于其他二聚体NAD-IDH,如猪链球菌(Streptococcus suis)IDH(Km=233μM;kcat/Km=0.176μM-1s-1)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)IDH(Km=312μM;kcat/Km=0.282μM-1s-1)。CcIDH表现的催化特征类似已知的单体NADP-IDH,即单体NADP-IDH的辅酶特异性及催化性质远好于二聚体NADP-IDH,单体NAD-IDH的辅酶特异性及催化性质也远好于二聚体NAD-IDH。因此,我们认为单体IDH的优良催化性质一定与其单体化的结构密切相关,但这还有待进一步的证实。
　　为了探讨单体IDH的进化机制,通过基于结构的序列比对和定点突变技术, CcIDH中的Thr579、Leu580和Leu591分别被突变成Lys、His和Arg。SDS-PAGE电泳显示,三点突变体酶CcIDH-TLL/KHR的亚基分子量约为65.0 kDa,与野生型CcIDH结果一致。酶动力学研究显示,突变体酶虽然是NADP+依赖性酶,但仍能利用辅酶NAD+。在Mn2+和Mg2+存在条件下:突变体酶对NAD+的Km分别是野生型CcIDH对NAD+的的56倍和12倍,说明突变体酶对NAD+的亲和性已显著下降;突变体酶对NADP+的Km分别比野生型CcIDH低40倍和283倍,说明突变体酶对NADP+的亲和性已显著升高;突变体酶对NAD+的Km分别是其对NADP+的 Km的22和21倍,说明突变体酶与 NADP+的亲和性高于其对 NAD+的亲和性,即突变体酶更偏向以 NADP+为辅酶。突变体酶的辅酶特异性基本实现了转换,即由原来的NAD+-依赖性酶转变为NADP+-依赖性酶。与不同来源的NADP-IDH相比,突变体酶对 NADP+的亲和性和催化效率远不如已知的单体NADP-IDH,但略高于二聚体NADP-IDH。
　　虽然单体NADP-IDH与二聚体NADP-IDH的序列同源性不高,但是基于结构的序列比对显示它们的底物、辅酶及金属离子结合位点拥有相似的保守氨基酸残基,尤其它们的晶体折叠拓扑结构惊人的相似。因此,目前认为二聚体NADP-IDH是单体 NADP-IDH的祖先蛋白。在长期的进化过程中,二聚体NADP-IDH由于部分基因的倍增、多重置换、插入和缺失,以及空间结构域的交换及单体化,从而演化出单体NADP-IDH。
　　单体NAD-IDH的发现和鉴定对上述假说提出了挑战。分子系统学分析显示,二聚体NAD-IDH在IDH家族进化过程中处于祖先地位,随后进化为两支:一支是二聚体NADP-IDH,另一支为单体IDH。研究发现还有一些其他细菌IDH的核苷酸序列与 CcIDH的一致性很高,而且这些细菌集中于螺菌科的弯曲菌属和螺杆菌属。因此,单体NAD-IDH可能是这些微生物适应环境的结果。
　　在这些研究结果的基础上,关于单体 IDH的进化机制,我们提出了自己的假说。首先,拥有古老表型的二聚体NAD-IDH的细菌,在特殊环境的选择压力下,经单体化形成只有一个活性中心的单体NAD-IDH。然后,在进化作用力的推动下,单体NAD-IDH进一步发生了分化:一部分生活在贫瘠碳源环境中的细菌,迫于体内生物合成对NADPH的需求,单体NAD-IDH发生了辅酶依赖性的转变,即由NAD+依赖性(古老性状)演化为NADP+依赖性(适应性状),形成单体NADP-IDH;另一部分细菌由于没有经历过环境的选择,所以保留了其NAD+的古老表型,仍然是单体 NAD-IDH。目前更多单体 NAD-IDH的功能鉴定工作正在进行中。

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第一章 综 述

1 简明弯曲菌概述

1.1 弯曲菌简介

1.2 简明弯曲菌

2 异柠檬酸脱氢酶

2.1 简介

2.2β-脱羧脱氢酶超家族

2.3 异柠檬酸脱氢酶的分类

2.4 异柠檬酸脱氢酶的三维空间结构特点

2.5 异柠檬酸脱氢酶的活性调节机制

2.6 异柠檬酸脱氢酶的辅酶特异性改造

3 研究意义和展望

参考文献

第二章简明弯曲菌IDH的表达和功能鉴定

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

2 实验结果和分析

2.1 CcIDH基因的克隆与鉴定

2.2 CcIDH的纯度检测

2.3 CcIDH的分子量测定

2.4 CcIDH的功能鉴定

3 讨论

参考文献

第三章 简明弯曲菌IDH的辅酶特异性研究

1 实验材料和方法

1.1 实验材料同第二章

2 实验结果与分析

2.1 序列分析

2.2 CcIDH突变基因的构建

2.3 突变体重组质粒的构建及鉴定

2.4 突变体酶CcIDH-TLL/KHR蛋白的表达与纯化

2.5 突变体酶的动力学参数分析

3 讨论

3.1 突变体酶动力学参数分析

3.2 单体IDH进化的可能途径

参考文献

致谢

附：